Scratch Migration analysen og rygg Skinfold Chamber for in vitro og in vivo analyse av såret healing
Summary
Her presenterer vi en protokoll for en in vitro scratch analysen ved hjelp av primære fibroblaster og for en in vivo hud såret healing analysen i mus. Begge analysene er enkle metoder for å vurdere in vitro-og in vivo-sår helbredelse.
Abstract
Nedsatt hud såret healing er en stor bekymring for pasienter som lider av diabetes og for eldre mennesker, og det er behov for en effektiv behandling. Hensiktsmessig in vitro og in vivo tilnærminger er avgjørende for identifisering av nye målmolekyler for narkotika behandlinger for å forbedre huden sår helbredelsesprosessen. Vi identifiserte β3 delenhet av spennings-gated kalsiumkanaler (Cavβ3) som en potensiell mål molekyl å påvirke såret healing i to uavhengige analyser, dvs., in vitro scratch migrasjon analysen og in vivo rygg skinfold kammer modell. Primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) akutt isolert fra vill-type (WT) og CAVβ3-mangelfull mus (CAVβ3 ko) eller FIBROBLASTER akutt isolert fra WT mus behandlet med siRNA å ned-regulere uttrykket av Cacnb3 Gene , koding CAVβ3, ble brukt. En ripe ble brukt på en confluent celle monolag og gapet nedleggelsen ble fulgt ved å ta mikroskopiske bilder på definerte tidspunkt poeng til fullstendig Repopulation av gapet ved å migrere celler. Disse bildene ble analysert, og cellen migrasjon rate ble bestemt for hver tilstand. I en in vivo-analyse implantert vi en rygg skinfold kammer på WT og Cavβ3 KO mus, anvendt en definert sirkulær sår på 2 mm diameter, dekket såret med et glass dekkglass for å beskytte den mot infeksjoner og uttørking, og overvåket makroskopisk såret nedleggelse over tid. Såret lukking var betydelig raskere i Cacnb3-genet-mangelfull mus. Fordi resultatene av in vivo og in vitro-analysene samsvarer godt, kan in vitro-analysen være nyttig for screening med høy gjennomstrømming før validering av in vitro-treffene ved in vivo-såret helbredende modell. Det vi har vist her for vill-type og CAVβ3-mangelfull mus eller celler kan også være aktuelt for spesifikke molekyler enn Cavβ3.
Introduction
Skin sår healing starter umiddelbart etter hudskader for å gjenopprette hudens integritet og for å beskytte organismen fra infeksjoner. Sår helbredelsesprosessen går gjennom fire overlappende faser; blødnings, betennelse, nye vevs dannelse og vevs remodeling1. Celle migrering er avgjørende i disse fasene. Inflammatoriske celler, immunceller, keratinocytter, endothelial celler, og fibroblaster er aktivert på ulike tidspunkt poeng og invadere såret området2. Metoder for å undersøke såret healing in vitro og in vivo er av stor interesse ikke bare å forstå de underliggende mekanismene, men også for å teste nye legemidler og å utvikle nye strategier som tar sikte på å forbedre og akselerere huden sår helbredelse.
For å overvåke og analysere celle migrering, kan du bruke scratch Migration-analysen. Det er ofte referert til som in vitro såret healing analysen. Denne metoden krever en cellekultur anlegg3. Det er en enkel prosedyre, er det ikke behov for High-End utstyr og analysen kan utføres i de fleste cellebiologi laboratorier. I denne analysen er en celle-fritt område skapt av mekanisk forstyrrelse av en confluent celle monolag, fortrinnsvis epitel-eller endothelial-lignende celler eller fibroblaster. Celler på kanten av scratch vil migrere for å gjenbefolke det opprettede gapet. Kvantifisering av den synkende celle-fritt område over tid ligner migrasjon hastighet og indikerer tiden, som cellene trenger for å lukke gapet. For dette formålet, kan etterforskere bruke enten akutt isolerte celler fra WT mus eller mus mangler et gen av interesse4, eller udødeliggjort celler tilgjengelig fra pålitelige celle repositories. Scratch analysen gjør det mulig å studere påvirkning av farmakologisk aktive forbindelser eller effekten av transfekterte cDNAs eller siRNAs på celle migrasjon.
In vivo, er sår helbredelse en kompleks fysiologisk prosess, som krever ulike celletyper, inkludert keratinocytter, inflammatoriske celler, fibroblaster, immunceller og endothelial celler for å gjenopprette hudens fysiske integritet så raskt som mulig1 . Ulike metoder for å studere in vivo såret healing har blitt utviklet og brukt i de siste5,6,7,8. Rygg skinfold kammeret beskrevet i denne artikkelen ble tidligere brukt til sår healing-analyser9. Den brukes som en modifisert rygg skinfold kammer forberedelse til mus. Den modifiserte skinfold kammer modellen har flere fordeler. 1) det minimerer hud sammentrekning, som hindrer observere sår helbredelsesprosessen og kan påvirke såret reparasjon i mus. 2) dette kammeret gjør bruk av dekker såret med et glass dekkglass, redusere vevs infeksjoner og uttørking, som kan forsinke helbredelsesprosessen. 3) blodstrøm og endometrial blodkar kan overvåkes direkte. 4) det tillater repeterende aktuell anvendelse av farmakologisk aktive forbindelser og reagenser for å behandle såret og akselerere helbredelse9,10.
Vi identifiserte β3 delenhet av høyspennings-gated kalsiumkanaler (Cavβ3) som en potensiell mål molekyl å påvirke huden såret healing ved hjelp av to uavhengige protokoller, dvs., in vitro scratch migrasjon analysen og in vivo rygg skinfold kammer modell. For in vitro-analysen, brukte vi primære fibroblaster, disse cellene gjør uttrykke Cacnb3 genet koding av Cavβ3 protein, men mangel depolarization-indusert ca2 + tilstrømningen eller spennings avhengig ca2 + strømninger. Vi beskrev en ny funksjon av Cavβ3 i disse fibroblaster: Cavβ3 binder seg til Inositol 1, 4, 5-trisphosphate reseptor (IP3R) og begrensninger kalsium utgivelse fra endoplasmatiske retikulum. Sletting av Cacnb3 genet i mus fører til økt følsomhet av IP3R for IP3, forbedret celle migrasjon og økt hud såret reparasjon4.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskriptet, beskriver vi en in vitro og in vivo såret healing analysen og relatere resultatene oppnådd. For in vitro-analysen, brukte vi primær mus fibroblaster4,14,15 som spiller en viktig rolle i såret healing og vev remodeling11. Andre tilhenger celletyper som vokser som monolagere (f. eks, epitelceller, endothelial celler, keratinocytter) kan brukes også. Plating samme antall levedyktig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Petra Weissgerber og transgene Unit av SPF dyr anlegget (prosjekt P2 av SFB 894) av medisinsk fakultet og dyret anlegget ved Institutt for klinisk og eksperimentell kirurgi ved medisinsk fakultet Saarland University, Homburg. Vi takker Dr. Andreas Beck for kritisk lesning av manuskriptet. Denne studien ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, prosjekt a3 til A.B. og V.F.).
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
