Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing
Summary
Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.
Abstract
Verminderde cutane wondgenezing is een belangrijke zorg voor patiënten die lijden aan diabetes en ouderen, en er is behoefte aan een effectieve behandeling. Geschikte in vitro en in vivo benaderingen zijn essentieel voor de identificatie van nieuwe doel moleculen voor medicamenteuze behandelingen om het huid wond genezingsproces te verbeteren. We identificeerden de β3-subeenheid van voltage-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om de wondgenezing te beïnvloeden in twee onafhankelijke testen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Primaire muis embryonale fibroblasten (Mef’s) acuut geïsoleerd van wild-type (WT) en CAVβ3-deficiënte muizen (CAVβ3 ko) of FIBROBLASTEN acuut geïsoleerd van WT muizen behandeld met siRNA naar beneden-reguleren de uitdrukking van het Cacnb3 gen , codering CAVβ3, werden gebruikt. Een kras werd aangebracht op een confluente celmonolayer en de spleet sluiting werd gevolgd door microscopische beelden op gedefinieerde tijdstippen te nemen tot volledige herbevolking van de kloof door de migrerende cellen. Deze beelden werden geanalyseerd en de Celmigratie snelheid werd voor elke aandoening bepaald. In een in vivo test hebben we een dorsale huidplooi kamer op WT-en Cavβ3 KO-muizen geïmplanteerd, een gedefinieerde cirkel wond van 2 mm diameter aangebracht, de wond bedekt met een glazen dekglaasje om het te beschermen tegen infecties en uitdroging, en de macroscopische wondsluiting bewaakt na verloop van tijd. Wondsluiting was significant sneller in Cacnb3-gen-deficiënte muizen. Omdat de resultaten van de in vivo en de in vitro assays goed correleren, kan de in vitro assay nuttig zijn voor de screening met hoge doorvoer voordat de in-vitro treffers worden valideerd door het in vivo wond genezings model. Wat we hier hebben laten zien voor wild-type en CAVβ3-deficiënte muizen of cellen kan ook toepasbaar zijn voor specifieke moleculen anders dan Cavβ3.
Introduction
Huid wondgenezing begint onmiddellijk na de huidletsel om de integriteit van de huid te herstellen en het organisme te beschermen tegen infecties. Het wond genezingsproces doorloopt vier overlappende fasen; coagulatie, ontsteking, nieuwe weefselvorming en weefsel remodellering1. Celmigratie is cruciaal tijdens deze fasen. Ontstekingscellen, immuuncellen, keratinocyten, endotheel cellen en fibroblasten worden op verschillende tijdstippen geactiveerd en dringen het wondgebied2binnen. Methoden om de wondgenezing in vitro en in vivo te onderzoeken zijn niet alleen van groot belang om de onderliggende mechanismen te begrijpen, maar ook om nieuwe geneesmiddelen te testen en nieuwe strategieën te ontwikkelen om huid wondgenezing te verbeteren en te versnellen.
Voor het bewaken en analyseren van Celmigratie kan de Scratch Migration test worden gebruikt. Het wordt vaak aangeduid als in vitro wondgenezing assay. Deze methode vereist een cel cultuur faciliteit3. Het is een eenvoudige procedure, er is geen behoefte aan high-end apparatuur en de assay kan worden uitgevoerd in de meeste cel biologie laboratoria. In deze test wordt een cel vrij gebied gecreëerd door de mechanische verstoring van een confluente celmonolayer, bij voorkeur epitheel-of endotheel achtige cellen of fibroblasten. Cellen aan de rand van de Scratch worden gemigreerd om de gemaakte kloof opnieuw te vullen. Kwantificering van de afnemende cel-vrije gebied na verloop van tijd lijkt op de migratiesnelheid en geeft de tijd, die de cellen nodig hebben om de kloof te sluiten. Voor dit doel kunnen onderzoekers ofwel acuut geïsoleerde cellen gebruiken van WT muizen of muizen die geen gen van belang4hebben, of vereeuwigd cellen die beschikbaar zijn via betrouwbare celopslagplaatsen. De Scratch assay maakt het bestuderen van de invloed van farmacologisch actieve verbindingen of het effect van gegeneerde Cdna’s of Sirna’s op Celmigratie mogelijk.
In vivo is wondgenezing een complex fysiologisch proces, waarbij verschillende celtypen nodig zijn, waaronder keratinocyten, ontstekingscellen, fibroblasten, immuuncellen en endotheel cellen om de fysieke integriteit van de huid zo snel mogelijk te herstellen1 . Verschillende methoden om te studeren in vivo wondgenezing zijn ontwikkeld en gebruikt in de afgelopen5,6,7,8. De in dit artikel beschreven dorsale huidplooi kamer werd eerder gebruikt voor wondgenezing testen9. Het wordt gebruikt als een gemodificeerde dorsale huidplooi kamer preparaat voor muizen. Het model met de aangepaste huidplooi kamer heeft verschillende voordelen. 1) het minimaliseert de contractie van de huid, die het observeren van het wond genezingsproces verhindert en de wond reparatie bij muizen kan beïnvloeden. 2) deze kamer maakt gebruik van het bedekken van de wond met een glazen dekglaasje, het verminderen van weefsel infecties en uitdroging, waardoor het genezingsproces kan vertragen. 3) doorbloeding en vascularisatie kan direct worden bewaakt. 4) het maakt repetitieve actuele toepassing van farmacologisch actieve verbindingen en reagentia mogelijk om de wond te behandelen en de genezing te versnellen9,10.
We identificeerden de β3 subeenheid van hoogspannings-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om huid wondgenezing te beïnvloeden met behulp van twee onafhankelijke protocollen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire fibroblasten, deze cellen uiten het Cacnb3 gen dat het cavβ3-eiwit codeert, maar gebrek aan depolarisatie-geïnduceerde CA2 + toestroom of spanning-afhankelijke CA2 + stromingen. We beschrijven een nieuwe functie van Cavβ3 in deze fibroblasten: Cavβ3 bindt aan de inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) en beperkingen calcium afgifte uit het endoplasmische reticulum. Deletie van het Cacnb3 gen in muizen leidt tot een verhoogde gevoeligheid van de IP3R voor IP3, verbeterde Celmigratie en verhoogde huid wond reparatie4.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een in vitro en in vivo wond genezings test en correleren we de verkregen resultaten. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire muizen fibroblasten4,14,15 die een belangrijke rol spelen in wondgenezing en weefsel remodellering11. Andere aanhangend celtypen die groeien als monolagen (bijv. epitheliale cellen, endotheel cellen, keratinocyten) kunnen ook worden gebruikt. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Petra Weissgerber en de transgene Unit van de SPF dieren faciliteit (project P2 van SFB 894) van de medische faculteit en de dieren faciliteit aan het Instituut voor klinische en experimentele chirurgie aan de medische faculteit van de Universiteit van Saarland, Homburg. We danken Dr. Andreas Beck voor de kritische lezing van het manuscript. Deze studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, project a3 tot A.B. en V.F.).
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
