Summary
Vi præsenterer en protokol for at studere mRNA-oversættelses regulering i poxvirus-inficerede celler ved hjælp af in vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay. Analysen kan bruges til at studere oversættelse regulering af CIS-elementer i en mRNA, herunder 5 '-uoversat region (UTR) og 3 '-UTR. Forskellige oversættelses Initierings tilstande kan også undersøges ved hjælp af denne metode.
Abstract
Hver poxvirus mRNA transkriberet efter viral DNA-replikation har en evolutionært bevaret, ikke-templated 5 '-poly (A) leder i 5 '-UTR. At dissekere rollen som 5 '-poly (A) leder i mRNA oversættelse under poxvirus infektion vi udviklet en in vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay. Denne reporter analyse består af fire centrale trin: (1) PCR at forstærke DNA-skabelon for in vitro transskription; (2) in vitro-transskription for at generere mRNA ved hjælp af T7 RNA-polymerase; (3) transfection at indføre in vitro transskriberet mRNA i celler; (4) påvisning af luciferaseaktivitet som indikator for oversættelse. Den RNA-baserede luciferase reporter assay beskrevet her omgår spørgsmål af plasmid replikation i poxvirus-inficerede celler og kryptisk transkription fra plasmid. Denne protokol kan bruges til at bestemme oversættelses reguleringen af CIS-Elements i en mRNA, herunder 5 '-UTR og 3 '-UTR i andre systemer end poxvirus-inficerede celler. Desuden, forskellige former for oversættelse indledning som Cap-afhængige, cap-uafhængig, re-initiering, og intern initiering kan undersøges ved hjælp af denne metode.
Introduction
Ifølge det centrale dogme strømmer genetiske oplysninger fra DNA til RNA og endelig til protein1,2. Denne strøm af genetiske oplysninger er stærkt reguleret på mange niveauer, herunder mRNA oversættelse3,4. Udvikling af reporter analyser til måling af regulering af genekspression vil lette forståelsen af reguleringsmekanismer, der er involveret i denne proces. Her beskriver vi en protokol til at studere mRNA oversættelse ved hjælp af en in vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay i poxvirus-inficerede celler.
Poxvira omfatter mange meget farlige humane og animalske patogener5. Ligesom alle andre vira, er poxvira udelukkende afhængige af Host Cell maskiner til proteinsyntese6,7,8. Til effektivt syntetisere virale proteiner, vira udviklet mange strategier til at kapre cellulære translationelle maskiner til at omdirigere det til oversættelse af viral mRNAs7,8. En almindeligt anvendt mekanisme af vira er at bruge CIS-virkende elementer i deres udskrifter. Bemærkelsesværdige eksempler omfatter den interne ribosome post site (IRES) og Cap-uafhængig oversættelses forstærker (Cite)9,10,11. Disse CIS-elementer gør de virale udskrifter til en translationel fordel ved at tiltrække translationelle maskiner via forskellige mekanismer12,13,14. Over 100 poxvirus mRNAs har en evolutionært bevaret CIS-virkende element i 5 '-uoversat region (5 '-UTR): en 5 '-poly (a) leder på meget 5 ' enderne af disse mRNAs15,16. Længden af disse 5 '-poly (a) ledere er heterogene og genereres af Glidningen af poxvirus-kodet RNA polymerase under transkription17,18. Vi, og andre, for nylig opdaget, at 5 '-poly (a) Leader giver en oversættelses fordel til en mRNA i celler inficeret med vaccinia virus (vacv), prototypiske medlem af poxvira19,20.
In vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay blev oprindeligt udviklet til at forstå rollen som 5 '-poly (a) leder i mRNA oversættelse under poxvirus infektion19,21. Selv om plasmid DNA-baserede luciferase reporter analyser har været meget udbredt, der er flere ulemper, der vil komplicere resultatet fortolkning i poxvirus-inficerede celler. Første, plasmider er i stand til at replikere i vacv-inficerede celler22. For det andet, kryptisk transkription ofte sker fra plasmid DNA18,23,24. For det tredje, VACV promotor-drevet transkription genererer poly (A)-leder af heterogene længder derfor gør det vanskeligt at kontrollere poly (A)-leder længde i nogle eksperimenter18. En in vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay omgår disse spørgsmål og data fortolkningen er ligetil.
Der er fire vigtige trin i denne metode: (1) polymerasekæde reaktion (PCR) til generering af DNA-skabelonen til in vitro-transskription; (2) in vitro-transskription for at generere mRNA; (3) transfektering at levere mRNA i celler; og (4) påvisning af luciferaseaktivitet som indikator for oversættelse (figur 1). Den resulterende PCR uancv indeholder følgende elementer i 5 ' til 3 ' retning: T7-Promoter, poly (a) leder eller ønsket 5 '-UTR sekvens, Firefly luciferase åben læse ramme (ORF) efterfulgt af en poly (a) hale. PCR uancv bruges som skabelon til at syntetisere mRNA ved in vitro transskription ved hjælp af T7 polymerase. Under in vitro transskription, m7G cap eller anden Cap analog er indarbejdet i nysyntetiseret mRNA. De udjævnede udskrifter er transficeret til ikke-inficerede eller VACV-inficerede celler. Celle lyatet opsamles på det ønskede tidspunkt efter transfektering at måle luciferase aktiviteter, der indikerer protein produktion fra transficeret mRNA. Denne reporter analyse kan bruges til at studere oversættelse regulering af CIS-element til stede i 5 '-UTR, 3 '-UTR eller andre regioner af en mRNA. Desuden kan den in vitro-transkriberet RNA-baserede assay anvendes til at studere forskellige mekanismer for oversættelse initiering, herunder Cap-afhængige initiering, cap-uafhængig initiering, re-initiering og intern initiering som IRES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. udarbejdelse af DNA-skabelon ved PCR for in vitro- transskription
- At forberede DNA-skabelonen ved PCR, design primere. Når designe primere overveje afgørende egenskaber som primer længde, udglødning temperatur (Tm), GC indhold, 3 ' ende med G eller C osv.
Bemærk: Beskrevet i detaljer i disse litteratur25,26,27. - Design primere til at generere PCR uancv, der indeholder følgende elementer i 5 ' til 3 ' retning: T7-Promoter, poly (a) leder, Firefly luciferase ORF og en poly (a) hale benævnt som T7_12A-fluc. Design primere (frem og tilbage) til at omfatte alle de ekstra elementer, der ikke findes i skabelonen DNA (figur 2a).
Bemærk: Sekvensen af alle elementer findes i tabel 1. - Medtag flere ekstra nukleotider i fremad primer (5 '-3 ')28, efterfulgt af T7-Promoter, poly (A)-leder eller ønsket 5 '-UTR-sekvens og ca. 20 nukleotider, Juster baseret på Tm, svarende til 5 ' enden af indberetteren gen Orf. Sørg for, at det tilsvarende område i primeren er identisk med sangens Sense-streng (+ streng).
Bemærk: For lang 5 '-UTR, syntetisere to DNA fragmenter: en med T7 promotor efterfulgt af lang 5 '-UTR og sekund med reporter gens ORF. Deltag i disse to fragmenter ved hjælp af overlap udvidelse PCR29. - Design reverse primer (5 '-3 ') til at omfatte poly (A) hale og ca 20 nukleotider, justere baseret på Tm, svarende til 3 ' enden af indberetteren genet ORF. Sørg for, at det tilsvarende område i primer er identisk med anti-sense-strengen (-streng) af genet og en in-frame stop codon er til stede før poly (A) hale.
Bemærk: Den ønskede længde af a's i en poly (A) leder eller poly (A) hale kan tilpasses i primere. For eksempel, for at tilføje 50 A er i poly (A) hale, den omvendte primer bør indebære 50 T's. Tilsvarende, at tilføje 20 A er i poly (A) leder, den forreste primer bør indebære 20 a's. - Til intern kontrol, designe et andet sæt af grundere, der indeholder følgende elementer i 5 ' til 3 ' retning: T7 Promoter, en tilfældig 5 '-UTR kodning sekvens, der indeholder Kozak sekvens, Renilla luciferase ORF og poly (a) hale benævnt T7_ Kozak-Rluc.
- I et PCR-rør tilsættes reagenserne i følgende rækkefølge: DNase frit vand, 2x high-fidelity DNA-Polymerase, primere, og sekvens bekræftet luciferase skabelon DNA (tabel 2).
Bemærk: Mængderne af de enkelte bestanddele i blandingen skal justeres i henhold til reaktions volumenet. - Brug en standard 3-trins (denaturering, annealing, Extension) PCR-cyklus til at generere en DNA-skabelon som vist i tabel 3.
Bemærk: Annealing temperatur X °c afhænger af primer sæt bliver brugt og forlængelse tid T min afhænger af PCR uancv størrelse og DNA-Polymerase anvendes. - Detektér PCR-produktet ved at løbe 5-10% af PCR-reaktionen i 1% agopstået Tris-acetat-EDTA (TAE) gel elektroforese (indeholdende 0,1 μg/ml ethidium bromid) sammen med kommercielt tilgængelig molekylvægt standard. Visualiser gelen under en UV-illuminator for at bestemme størrelsen af PCR-produktet.
- Efter bestemmelse af den korrekte størrelse af PCR-produktet, ~ 1,7 KB til T7_12A-Fluc og ~ 1,0 KB til T7_Kozak-Rluc, skal du rense det ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt PCR-rensningsudstyr. Elute DNA med 100 μL nuklease frit vand (figur 2b).
- Når renset, kontrollere koncentrationen af DNA ved hjælp af et spektrofotometer og bestemme A260/A280 ratio (~ 1.8-2,0 er acceptabel).
- Oprenset DNA opbevares ved-20 °C eller anvendes til in vitro-transkription med det samme.
2. Generer mRNA ved in vitro transskription
-
Syntetisere RNA fra PCR- produktet in vitro ved hjælp af et in vitro-transkription Kit (figur 3a).
Bemærk: T7_12A-Fluc-og T7_Kozak-Rluc-DNA-skabeloner bruges til at syntetisere henholdsvis 12a-fluc og Kozak-Rluc mRNAs.- For at gøre dette, skal du tage et mikrocentrifuge glas og tilsæt reagenserne i følgende rækkefølge: DNase-RNase frit vand, NTP buffer mix, cap analog, skabelon PCR produkt, T7-RNA polymerase mix (tabel 4).
Bemærk: Andre capping systemer kan også bruges til at Cap RNA sekventielt efter in vitro transskription efter producentens instruktion. - Bland grundigt og inkube ved 37 °C i 2 timer.
- Fortsæt til rensningen af det syntetiserede RNA ved hjælp af et RNA-rensningsudstyr.
- For at gøre dette, skal du tage et mikrocentrifuge glas og tilsæt reagenserne i følgende rækkefølge: DNase-RNase frit vand, NTP buffer mix, cap analog, skabelon PCR produkt, T7-RNA polymerase mix (tabel 4).
- Kør renset RNA i 1,5% agopstået Tris-borate-EDTA (TBE) gel (indeholdende 0,5 μg/mL ethidium bromid) for at kontrollere RNA. Visualiser gelen under en UV-illuminator (figur 3b).
- Kontrollér koncentrationen af RNA ved hjælp af et spektrofotometer, og bestem forholdet A260/A280 (~ 1,8-2,0 er acceptabelt).
- Alikvot renset RNA og opbevares ved-80 °C.
3. transfect mRNA til celler
- Frø HeLa celler i en 24-brønd plade (at være ca. ~ 80-90% konflydende næste dag) og inkubere natten i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Inficere HeLa celler med vaccinia virus (VACV) ved en mangfoldighed af infektion (MOI) af 5 eller holde uinficerede HeLa celler til sammenligning.
Bemærk: MOI er antallet af infektiøse virale partikler pr. celle. - MOI af X = {[(antal celler * X)/virus titer] * 1000} μl virus pr. 1 mL medium.
-
Efter ønsket h post infektion (HPI) (i dette eksperiment ved 10-12 HPI), transficere mRNA (500 ng af total mRNA pr brønd af 24-brønd plader) ved hjælp af en kationisk lipid transfektering reagens som vist i figur 3c.
- For en brønd af en 24-brønd plade, bland 480 ng af 12A sekvens leje Firefly luciferase (12A-Fluc) mRNA og 20 ng af Kozak sekvens leje Renilla luciferase (Kozak-rluc) mRNA i et mikrocentrifuge glas. I et andet mikrocentrifuge rør tilsættes 1,1 μl kationisk lipid transfektering reagens.
- Der tilsættes 55 μL reduceret serum medium i begge rør. Bland og inkuperer ved stuetemperatur i 5 min.
- Efter 5 min inkubation tilsættes 55 μl kationisk lipid transfektering reagens indeholdende reduceret serum medium i mRNA-holdige rør.
- Bland forsigtigt, men grundigt, og inkuperer ved stuetemperatur i 15 min.
- Under inkubationen fjernes celle dyrkningsmediet, og der tilsættes 400 μL reduceret serum medium pr. brønd af 24-brønd plader.
- Efter inkubation tilsættes 100 μl af blandingen dråbevis og jævnt til en brønd af 24-brønd plader.
4. mål Luciferaseaktiviteter
- 5-timers post-Co-Transfektion af 12a-fluc og Kozak-rluc mRNA, måler luciferaseaktivitet ved hjælp af et luciferase-analyse system, der kan udføre to reporter analyser (f. eks. dobbelt luciferase reporter assay Kit).
- Fjern det reducerede serum medium og lysere cellerne ved at tilføje 150 μL 1x lysis buffer, en bestanddel af luciferase assay kit.
- Efter 10 min inkubation ved stuetemperatur skal lyatet opsamles ved skrotning af cellerne og overføres til et mikrocentrifuge glas.
- Der centrifugeres i lysatet ved 12.000 x g i 10 min ved 4 °c til pellet cellerester.
- Der tilsættes 30 μL supernatanten i uigennemsigtig 96 brønd hvid analyse plade med en fast bund.
- Mål Dual luminescens ved hjælp af luciferase assay kit og en multi-mode plade læser luminometer.
- Udfør målingen ved hjælp af kinetik funktionen (pr. brønd) ved hjælp af de indstillinger, der er beskrevet i tabel 5.
Bemærk: Aflæsning kan også tages ved hjælp af manuel luminometer. Tilsæt en tilsvarende mængde af lysat og substrat for Fluc i en kuvette. Vent 2 s og mål for 10 s ved hjælp af luminometer. Efter Fluc måling, hurtigt tage ud kuvette fra luminometer og tilføje en tilsvarende mængde af substratet for Rluc manuelt. Igen, vente 2 s og måle for 10 s ved hjælp af luminometer. - Eksporter luminescens læse data til et ønskværdigt filformat.
- Bestem relativ oversættelses hastighed fra 12A-Fluc mRNA i ikke-inficerede og VACV inficerede HeLa-celler ved at dividere Fluc-værdien med den interne kontrol Rluc værdi.
Bemærk: Supplerende figur 1 viser trin-for-trin analyse af rå data for at få relativ fluc aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fire trin af in vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay: PCR til at generere DNA-skabelon til in vitro transkription, in vitro transkription til at generere mRNA, mRNA transfection, og luciferase måling, kan ses i skematisk diagram ( Figur 1). Design af primere til både DNA-skabeloner (Fluc og Rluc) og den generelle ordning for udhæng forlængelse PCR er illustreret i skematisk (figur 2a). Efter PCR blev det korrekte mellemstore PCR-produkt detekteret af TAE agrose gel elektroforese (figur 2b). Derefter anvendes PCR-produktet som skabelon til at syntetisere RNA in vitro (figur 3a), som renses og køres i TBE-gel elektroforese for at verificere størrelsen (figur 3b). Den rensede og verificerede mRNA overføres til celler ved hjælp af kationisk lipid transfektering reagens (figur 3c). Primere, der anvendes i denne protokol, er anført i tabel 6.
In vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay blev udviklet til at forstå rollen som 5 '-poly (A) leder i mRNA oversættelse under poxvirus infektion. Ved hjælp af denne analyse, testede vi oversættelses effektiviteten af en Fluc mRNA, der indeholder en 5 '-poly (A) leder (12 NT) i uinficerede og VACV-inficerede celler. Fluc-værdien blev normaliseret ved anvendelse af Rluc-værdi i både ikke-inficerede og VACV-inficerede celler til bestemmelse af den relative Fluc-aktivitet (dvs. Fluc-aktivitet/Rluc-aktivitet) (figur 4a). Opdelingen af fluc ved rluc normaliserede transfektering effektivitet og RNA stabilitet i en særlig brønd. Ved hjælp af denne analysemetode fastslog vi, at en 5 '-poly (A)-leder, der indeholder mRNA, har en translationel fordel under VACV-infektion (figur 4b). Fordelen i inficerede celler skyldtes ikke differentialtransfektivitet eller mRNA-stabilitet, da RNA-niveauet var ens i ikke-inficerede og vacv-inficerede celler 5 timer efter mRNA-transfektering19.
Figur 1: skematisk af forsøgs proceduren. PCR bruges til at generere en DNA-skabelon med de ønskede elementer. mRNA-kodning af et luciferase-reporter-gen syntetiseres in vitro ved hjælp af et T7 RNA-polymerasebaseret system. En Firefly luciferase (Fluc) mRNA er co-transficeret med en Renilla luciferase (Rluc) mRNA i ikke-inficerede eller VACV-inficerede celler. Luciferaseaktiviteter måles ved hjælp af et luminometer med dobbelt luciferaseevne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: primer-design og PCR-baseret DNA-forstærkning. (A) den forreste primer er syntetiseret til at omfatte en 8nt tilfældig sekvens, T7 promotor efterfulgt af en ønsket 5 '-UTR og en del af 5 ' enden af luciferase reporter genet, mens den omvendte primer omfatter en T-kanal til at generere poly (a) hale og 3 ' enden af luciferase reporter-genet. Ved at over hænge Extension PCR ved hjælp af en plasmid-skabelon, der indeholder et luciferase-gen, genereres en DNA-skabelon. (B) DNA-bånd af den ønskede størrelse fra PCR-reaktion blev detekteret ved hjælp af 1% AGOPSTÅET Tae gel elektroforese. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mRNA syntese og transfection. (A) skematisk af in vitro transskription. DNA forstærket med PCR, der indeholder luciferase-genet neden for 5 '-UTR af interesse, og T7-promotoren anvendes som skabelon. T7 RNA-polymerase rekrutteres til initiativtageren og tilføjer ribonucleotider, vist i hvidt, fra 5 ' til 3 ' retning. Når mRNA er 25-30 NT lang, m7G Cap tilsættes ved hjælp af en anti-reverse Cap analog, Arca. (B) RNA-bånd fra in vitro-transkription ware detekteret ved hjælp af 1,5% AGOPSTÅET TBE-gel elektroforese. (C) skematisk påvisning af transfektering af reporter mRNA i celler. Medium indeholdende enten indberetteren mRNA eller kationisk lipid transfektering reagens i separate rør er tilladt at ækvilibrere ved stuetemperatur i 5 min. Løsningerne blandes derefter efterfulgt af inkubation ved stuetemperatur i 15 minutter, hvorefter RNA/transfection reagens blandingen tilsættes i celler i kultur plader. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: øget translationel effektivitet af mRNA, der indeholder en 5 '-poly (a) leder. (A) Fluc mRNA, der indeholder en poly (a)-leder i 5 '-UTR og Rluc mRNA med Kozak-konsensus sekvensen i 5 '-UTR, er co-transficeret til celler. (B) Fluc mRNA med 5 '-poly (a) leder blev transficeret i uinficerede og vacv-inficerede celler sammen med Rluc mRNA. 5 HPI blev luciferaseaktivitet målt ved hjælp af et luminometer. Rluc normaliseret Fluc aktivitet er repræsenteret i ikke-inficerede og VACV-inficerede celler. Fejllinjer angiver standardafvigelserne (SD) på mindst tre gentagelser. Student's t-test blev brugt til at bestemme P-værdier; P-værdi < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Elementer | Sekvens |
| T7 Promoter | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Poly (A) leder | AAAAAAAAAAAA, spænder fra 3 til 51 som |
| Kozak-sekvens | GCCACC |
| Poly (A) hale | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA...... |
Tabel 1: sekvenser anvendt i metoden – tabellen indeholder sekvenser af T7-promotoren, poly (A)-lederen, Kozak-sekvensen, poly (A)-hale.
| Komponenter | Volumen |
| DNase frit vand: | 38 μL |
| 2X high-fidelity DNA Polymerase Master Mix: | 50 μL |
| Fremad primer (10 μM): | 4 μl af |
| Omvendt primer (10 μM): | 4 μl af |
| Luciferasedna-skabelon (1-10 ng/μL): | 4 μl af |
| Samlede: | 100 μL |
| Kilde til Fluc DNA-skabelon er pGL3-Fluc plasmid | |
| Kilde til Rluc DNA-skabelon er pRL-Rluc plasmid |
Tabel 2: PCR-reaktion – rækkefølgen og mængden af komponenter, der er tilføjet i PCR-reaktionen.
| Trin | Temperatur | Tid | Cyklus |
| Første denaturering | 95 °C i | 2 min. | (1x cyklus) |
| Denaturering | 95 °C: | kun 15 s | |
| Udglødning | X °c: | kun 30 s | (25x cyklus) |
| Udvidelse | 72 °C: | T min | |
| Endelig udvidelse | 72 °C: | 7 min. | (1x cyklus) |
| Holde | 4 °C: | ∞ |
Tabel 3: PCR-program – trinene for PCR-program sammen med temperatur, tid og cyklus.
| Komponenter | Volumen | |
| DNase-RNase frit vand: | op til 20 μL | |
| NTP-buffer blanding (20 mM af hver rNTP): | 2 μL | |
| Cap analog (40 mM): | 4 μL af | |
| Skabelon PCR produkt (400 ng) *: | X μl | (PCR produkt koncentration afhængig) |
| T7-RNA-polymerase-mix: | 2 μL | |
| Samlede: | 20 μL | |
| * T7_12A-Fluc og T7_Kozak-Rluc skabelon bruges til at syntetisere 12A-Fluc og Kozak-Rluc mRNA, hhv. |
Tabel 4: in vitro-transskription reaktion – rækkefølgen og mængden af komponenter tilføjet til in vitro-transkription reaktion.
| Trin | Lydstyrke/tid |
| Injicér luciferase-analyse substrat (Fluc): | 30 μL |
| Ventetid/inkubationstid: | 2 s i |
| Luminescens måling (Fluc): | 10 s |
| Stop & Glo substrat (Rluc): | 30 μL |
| Ventetid/inkubationstid: | 2 s i |
| Luminescens måling (Rluc): | 10 s |
Tabel 5: indstillinger for luciferase-måling – trinnene til måling af luciferase med den anbefalede mængde eller tid.
| Primere | Sekvens |
| T7-12A-Fluc fremad | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGaaaaaaaaaaaa ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG |
| T7-12A-Fluc reverse | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT, der er en gruppe |
| T7-Kozak-Rluc Forward | Har du en overgang til at gøre det... ATGACTTCGAAAGTTAN |
| T7-Kozak-Rluc reverse | KTTTTTTTTTTTTTAFTTTTTTTTTT (en) GAGAACTCGCTC |
Tabel 6: grundere – de grundere, der anvendes i denne metode med komplette sekvenser.
Supplerende figur 1: analyse af rådata – trin til analyse af rådata for at få normaliserede data. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle fire-core trin er afgørende for succesen af in vitro transskriberet RNA-baserede luciferase reporter assay. Der bør lægges særlig vægt på primer-design, især for T7-promotoren. T7 RNA-polymerase starter transkription fra det understregede første G (ggg-5'-UTR-aug-) i T7 promotoren, der er tilføjet før 5 '-UTR-sekvensen. Selvom transskription startstedet (TSS) starter fra den første G ved 5 ' enden, reducerede antallet af G's mindre end tre i T7 promotionsregion RNA-udbyttet/outputtet fra in vitro transskription. Under eksperimentet observerede vi, at gel-renset DNA-produkt ikke var det bedste til in vitro transskription, da både udbyttet og kvaliteten af RNA var lavere. Vi kørte kun 5-10% af PCR-reaktionen i 1% agopstået gel elektroforese til at bestemme størrelsen og renset resten 90-95% ved hjælp af et PCR rensningsanlæg, der skal anvendes til in vitro transskription. I tilfælde af ikke-specifik forstærkning fra PCR anbefales det at klippe det ønskede størrelses bånd fra gel og anvende gel-renset DNA-fragment. Da udbyttet kan være lavt, foreslår vi at øge reaktions volumen for in vitro-transkription reaktion. Ligesom andre transfection-baserede metoder, DNA/RNA kan stimulere DNA/RNA sensing veje, der kan globalt eller selektivt undertrykke oversættelse. Derfor bør data fortolkes med forsigtighed, selv om vi ikke har oplevet problemer, der potentielt skyldes dette problem i vores eksperimenter.
Den foreslåede metode er velegnet til brug i forskellige modelsystemer med nogle ændringer som metoden til mRNA levering, intern kontrol, der skal anvendes, et passende tidspunkt for oversættelse, prøveforberedelse og analyse af data. Den vigtigste begrænsning af denne metode er, at det er en reporter assay til hurtigt at teste oversættelse regulering af CIS elementer, der ikke helt afspejler fysiologiske forhold. Derfor bør denne metode underbygges af andre komplementære eksperimenter, hvis det er muligt.
Sammenlignet med DNA-modificering er rollerne for RNA-modifikationer mindre velforståede. Men med opdagelsen af enzymer, der skriver, læser og sletter RNA modifikationer30,31,32,33,34,35, er det nu muligt at studere indflydelsen af RNA-modifikation i genekspression30,31,32,33,34,35. In vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay kan modificeres til at indarbejde forskellige RNA modifikationer og anvendes til at teste deres virkninger på RNA oversættelse. For eksempel kan denne metode indarbejde forskellige Cap analoler, der har forskellige modifikationer30,31. Derudover kan supplering af et internt RNA-modificerende enzym under eller efter in vitro-transkription muligvis inkorporere intern RNA-modifikation. Tilføjelse af en ændring af hætten 0, cap 1, og en intern RNA modifikation vil give et værktøj til at studere rollerne af disse RNA modifikationer i oversættelsen.
In vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay har et stort potentiale og bred anvendelse i forståelsen grundlæggende biologi om RNA oversættelse. Forskellige mekanismer for indledning af oversættelse, herunder Cap-afhængige initiering, cap-uafhængig initiering, genoptagelse og intern initiering såsom IRES kan undersøgt ved hjælp af denne metode. Ud over disse fordele, kan denne analyse anvendes til at teste oversættelse regulering af CIS-Elements på 5 '-UTR og 3 '-UTR i en mRNA. Den beskrevne protokol bruger PCR-produktet, som giver fordelen ved at undgå langvarig kloning og hurtigt undersøge virkningerne af RNA-elementer på oversættelsen. For at minimere potentielle fejl under PCR bør der anvendes high fidelity polymerase og lav PCR-cyklus nummer. Alternativt, hvis en skabelon bruges hyppigt, den ønskede 5-' UTR og luciferase ORF kan klones i en plasmid som skabelon for in vitro transskription. Sammen konsoliderer protokollen transkription og mRNA capping i en enkelt reaktion og udnytter konventionel transfektering og analyse, der gør in vitro transskriberet RNA-baseret luciferase reporter assay en brugervenlig, hurtig og ligetil metode at studere mekanismerne i mRNA oversættelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne vil gerne erklære, at der ikke er nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Projektet blev finansieret af National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) til ZY og delvis af Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) i form af graduate Student Summer Stipend til PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
