Summary
De vriesontdooi methode wordt gebruikt voor de productie van Chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels zonder dwars verbindingsmiddelen. Voor deze methode is het belangrijk om de Vries condities (temperatuur, aantal cycli) en polymeer verhouding te overwegen, wat de eigenschappen en toepassingen van de verkregen hydrogels kan beïnvloeden.
Abstract
Chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels kunnen worden geproduceerd door middel van de Freeze-Thawing-methode zonder gebruik te maken van giftige crosslinking-agenten. De toepassingen van deze systemen worden beperkt door hun kenmerken (bijv. porositeit, flexibiliteit, zwelling capaciteit, drugs belasting en geneesmiddelafgifte capaciteit), die afhangen van de Vries condities en de aard en verhouding van polymeren. Dit protocol beschrijft hoe u hydrogels van Chitosan en poly (vinyl alcohol) bereiden op 50/50 w/w% van de polymeer samenstelling en de vriestemperatuur variëren (-4 °C,-20 °C,-80 °C) en vries dooi cycli (4, 5, 6 Vries cycli). FT-IR spectra, SEM Microscoop en porosimetrie gegevens van hydrogels werden verkregen. Ook werden de zwelling capaciteit en drug laden en vrijlating van bifenylstructuur beoordeeld. Resultaten van SEM micro Foto's en porosimetrie tonen aan dat de poriëngrootte afneemt, terwijl de porositeit toeneemt bij lagere temperaturen. Het zwelling percentage was hoger bij de kleine vriestemperatuur. De afgifte van bifenylstructuur uit de hydrogels is bestudeerd. Alle netwerken handhaven de drug vrijlating voor 30 h en geconstateerd is dat een eenvoudige diffusie mechanisme regelt de bifenylstructuur vrijlating volgens korsmeyer-peppas en Higuchi modellen.
Introduction
Onlangs hebben hydrogels veel interesse in het biomedische gebied, omdat het driedimensionale netwerken zijn met een hoog watergehalte en zacht en flexibel zijn, zodat ze natuurlijke weefsels gemakkelijk kunnen nabootsen1. Ook, ze niet oplossen in waterige medium op fysiologische temperatuur en pH maar presenteren een grote zwelling2. Hydrogels kunnen fungeren als tissue engineering steigers, hygiëne producten, contactlenzen en wondverbanden; omdat ze kunnen vangen en vrijgeven van actieve verbindingen en drugs, ze worden gebruikt als drug delivery Systems3. Afhankelijk van hun toepassing kunnen hydrogels worden gemaakt van natuurlijke of synthetische polymeren, of een combinatie van beide, om de beste eigenschappen te verkrijgen4.
De eigenschappen van hydrogels zijn een gevolg van vele fysische en chemische factoren. Op fysiek niveau zijn hun structuur en morfologie afhankelijk van hun porositeit, poriegrootte en porie verdeling5. Op chemisch en moleculair niveau zijn het polymeer type, de hydrofiele groepsinhoud in de polymeer keten, het kruiskoppelings punt type en de kruislings verbindende dichtheid de factoren die de zwelling capaciteit en de mechanische eigenschappen6,7bepalen.
Volgens het type crosslinking-middel dat wordt gebruikt om het netwerk te vormen, worden de hydrogels geclassificeerd als chemische hydrogels of fysische hydrogels. Chemische hydrogels worden samengevoegd met covalente interacties tussen hun ketens, die worden gevormd door UV-en gamma-bestraling of met behulp van een crosslinking-agent7,8. Chemische hydrogels zijn meestal sterk en resistent, maar in het algemeen is de crosslinking-agent giftig voor de cellen en de verwijdering ervan is moeilijk, dus de toepassing ervan is beperkt. Aan de andere kant vormen fysische hydrogels door de aansluiting van de polymeerketens door niet-covalente interacties, waarbij het gebruik van crosslinking-agenten4,9wordt vermeden. De belangrijkste niet-covalente interacties in het netwerk zijn hydrofobe interacties, elektrostatische krachten, complementaire en waterstof grenzen7.
Poly (vinyl alcohol) (PVA, Figuur 1a) is een synthetisch en in water oplosbaar polymeer met uitstekende mechanische prestaties en biocompatibiliteit die kunnen worden van cross link agent-Free hydrogels door middel van de Freeze-Thawing methode10,11. Dit polymeer heeft de capaciteit om geconcentreerde zones van waterstofbindingen te vormen tussen-OH-groepen van hun ketens (kristallijne zones) wanneer ze12bevriezen. Deze kristallijne zones fungeren als crosslinking-punten in het netwerk en worden gepromoot door twee gebeurtenissen: het naderen van de polymeerketens wanneer het kristalwater zich uitbreidt en de PVA-conformationele veranderingen van isotactiek naar syndiotactische PVA tijdens Freeze13. Door het vriesdrogen worden de waterkristallen gesublimeerd, waardoor er leegte ruimten zijn die de poriën in de hydrogel14zijn. Om hydrogels met betere eigenschappen te verkrijgen, kan PVA gemakkelijk worden gecombineerd met andere polymeren.
In die zin vormt Chitosan een optie omdat het het enige biopolymeer is van natuurlijke bronnen met positieve ladingen. Het wordt verkregen door de deacetylering van chitine en het bestaat uit willekeurige combinaties van β-1, 4 gekoppelde D-glucosamine (deacetylated Unit) en N-acetyl-D-glucosaminehoudende (geacetoneerde eenheid)15,16 (Figuur 1b). Chitosan is biologisch afbreekbaar door menselijke enzymen en het is biologisch compatibel. Ook, door zijn kationische aard, het kan communiceren met de negatieve lading van het celoppervlak, en deze eigenschap is geassocieerd met zijn antimicrobiële activiteit17. Dit polymeer is eenvoudig te verwerken; echter, hun mechanische eigenschappen zijn niet voldoende en sommige materialen zijn toegevoegd aan het vormen van complexen met betere kenmerken.
Gezien de specifieke kenmerken van Chitosan en PVA, is de succesvolle vervaardiging van hydrogels bereikt met de Vries-ontdooiing methode2,18 om het gebruik van toxische crosslinking-agenten te voorkomen. In Chitosan-PVA-hydrogels worden de kristallijne zones van PVA ook gevormd, en Chitosan ketens worden doorgedrongen en vormen eenvoudige waterstofbindingen met-NH2 groepen en-Oh groepen in PVA. De laatste Chitosan-PVA hydrogel is mechanisch stabiel, met hoge frequenties van zwelling en lage toxiciteit, en met antibacteriële werking18. Afhankelijk van de Vries condities die in het preparaat worden gebruikt (temperatuur, tijd en aantal cycli), kunnen de uiteindelijke eigenschappen echter veranderen. Sommige studies melden dat het verhogen van het aantal bevriezings cycli vermindert de zwelling graad en verhoogt de treksterkte19,20. Om het netwerk te versterken, zijn andere middelen, zoals gamma-en UV-straling en chemische reologie, aanvullend gebruikt na de Vries ontdooide voorbereiding21,22,23. Hydrogels met een hogere Chitosan verhouding hebben een meer poreus netwerk en een hoge zwelling capaciteit, maar minder sterkte en thermische stabiliteit. In deze context is het belangrijk om de bereidings voorwaarden te overwegen om geschikte hydrogels te verkrijgen voor hun doeltoepassing.
Het doel van dit werk is om gedetailleerd te presenteren hoe de Vries condities (temperatuur van bevriezing en aantal cycli) van invloed zijn op de uiteindelijke kenmerken van CS-PVA-hydrogels. FT-IR spectra, morfologische en porositeit eigenschappen en zwelling capaciteit werden geëvalueerd, evenals drug loading en release capaciteit. In de release studies werd bifenylstructuur (Figuur 1c) gebruikt als model medicijn, vanwege de grootte die geschikt is voor de hydrogel structuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Chitosan-PVA-hydrogels
- Bereid 2% (w/w) Chitosan en 10% (w/w) PVA-oplossingen voor. Los 0,2 g Chitosan op in 10 mL 0,1 M CH3COOH-oplossing (eerder gefilterd) bij kamertemperatuur en houd 's nachts continu mechanisch roeren. Los 1 g PVA op in 10 mL gedistilleerd water en roer gedurende 1 uur bij 80 °C.
- Meng beide oplossingen 1:1 met behulp van een magnetische roerder tot ze homogeen zijn bij kamertemperatuur, en giet de mengsels op Petri schalen. Laat de monsters 2 uur bij atmosferische druk op Degas.
- De hydrogels bevriezen bij-4 °C,-20 °C of-80 °C gedurende 20 uur en 4 cycli (monsters CP4-4, CP4-20 en CP4-80, respectievelijk). Vries nog een hydrogel in bij-80 °C gedurende 20 uur met 5 of 6 Vries cycli (monsters CP5-80 en CP6-80). Na de derde Vries cyclus was de hydrogels met gedeïoniseerd water. Op het einde, bevriezen-droog de hydrogels bij-46 °C voor 48 h en opslaan voor verdere karakterisering (methodologie aangepast uit2).
2. FT-IR-karakterisering
- Plaats een klein stukje hydrogel (1 mm x 2 mm) in de FT-IR-spectrometer in de ATR-modus. Neem de FT-IR spectra van 4000 tot 600 cm-1 (2 cm-1 van resolutie en gemiddelde van 32 scans).
3. zwelling van de assays
- Knip schijven (13 mm in diameter en 10 mm hoog) uit de hydrogel en weeg ze af. Incuberen de schijven in 50 mL gedeïoniseerd water met schudden bij 25 °C. Herhaal dit drie keer.
- Elke 30 min Verwijder het monster van het medium, Blotter om het overtollige water te elimineren en weeg. Bereken de zwelling graad met behulp van de vergelijking 1 en bereken de evenwichtstoestand van
zwelling,, bij 24 h met behulp van de vergelijking 2.
)
Waar
is het gewicht van de droge hydrogel en 
is het gewicht van de natte hydrogel.
zwelling,, bij 24 h met behulp van de vergelijking 2.
)
is het gewicht van de droge hydrogel en 
is het gewicht van de natte hydrogel.
4. elektronische microscopie
- Bedek een klein stukje hydrogel met een dunne gouden laag (30 s en 10 mA) in een sputteren coater.
- Steek het monster in een scanning elektronen microscoop (SEM). Analyseer de monsters onder vacuüm bij 20 kV en neem de beelden met een vergroting van 500x en 1500x.
5. porosimetrie
- Plaats schijven met een diameter van 15 mm en een gewicht van ongeveer 0,26 g in de penetratie (een massieve penetratie, met een bulk volume van 0,3660 ml en 5,7831 ml van het stam volume). Analyseer de porositeit en poriegrootte door kwik inbraak porosimetrie (MIP).
- Voer het experiment uit in de hysterese-modus (inbraak-extrusie). Meet het totale inbraak volume (mL/g), het totale porie gebied (m2/g), porie diameter (μm), porositeit (%), permeabiliteit (mDarcy) en tortuositeit. Herhaal dit twee keer.
6. drug laden en vrijgeven
- Voor het laden, bereid 4 L van 15 mg/L diflunisale oplossing en roer 's nachts. Bevestig de concentratie van de oplossing met UV-VIS-spectroscopie (initiële concentratie). Inderdaad, zwellen 400 mg gevriesdroogde monsters van hydrogel in 6 mL gedistilleerd water voor 24 h.
- Vul voor het laden een kolf met 50 mL diflunisale oplossing en houd bij 25 °C constant roeren. Dompel de hydrogel in de kolf.
- Neem op verschillende tijdstippen aliquots van de resterende diflunisale oplossing (2 mL) om de plateau regio van de curve te bepalen, bijvoorbeeld: 3, 6, 24, 27, 30 en 48 u. Na 24 h de oplossing vervangen door een nieuwe.
- Meet de extinctie op 252 nm van elk aliquot en bepaal de concentratie diflunisale die aanwezig is in de oplossing met behulp van een ijkcurve van diflunisaal. Bereken de hoeveelheid bifenylstructuur die in de hydrogel wordt vastgehouden bij 24 en 48 uur, als het verschil tussen de initiële en de eindconcentratie, rekening houdend met het totale volume (56 ml).
- Bepaal de inkapings efficiëntie (EE) met behulp van de vergelijking 3.
- Vries de geladen hydrogels bij-80 °C en lyophilize bij-50 °C.
- Bepaal de inkapings efficiëntie (EE) met behulp van de vergelijking 3.
- Voor de afgifte van geneesmiddelen, submerge 300 mg gevriesdroogde diflunisale geladen hydrogels in 50 mL fosfaatbuffer (pH 7,4) bij 25 ° c. Blijf constant roeren. Zuig aliquots van 2 mL op verschillende tijdstippen op en vervang het met vers medium om een constant volume te behouden.
- Bepaling van de diflunisale die spectrofotometrisch is vrijgegeven bij 252 nm, volgens een ijkcurve.
- Afleiden van de overheersende drug release mechanisme in de hydrogels aanpassen van de drug release gegevens die overeenkomen met de eerste 60%, naar de Korsmeyer-Peppas model (vergelijking 4), om de kinetische (k) en de diffusie (n)-constanten te verkrijgen. De n waarden geven het mechanisme van drug release24,25. Dan, n waarden dicht bij 0,5 zijn gerelateerd aan fickian Diffusion, ondertussen waarden van 0.5-1.0 voor afwijkend transport, waar zijn betrokken diffusie en ontspannings ketens, en ten slotte, waarden van 1,0 zijn gerelateerd aan Case II transport.
- Als u de resultaten wilt bevestigen, gebruikt u de wiskundige modellen Higuchi, first order en Zero order (vergelijkingen 5 tot en met 7) en selecteert u de betere pasvorm.
-
waarbij t de vrijgavetijd vertegenwoordigt, MT de hoeveelheid geneesmiddel die op een gegeven moment wordt afgeleverd, en M∞ de totale hoeveelheid geneesmiddel die aan het einde van het proces wordt afgeleverd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbereiding van hydrogels
Chitosan-PVA-hydrogels werden verkregen bij-4 °C,-20 °C en-80 °C met 4 Vries cycli en bij-80 °C met 5 en 6 Vries cycli door de eerder gemelde bevriezings methode2. Alle hydrogels waren homogeen, semi-transparant, flexibel en bestand tegen manipulatie.
FT-IR-karakterisering
De FT-IR spectra zijn weergegeven in Figuur 2. Zeven karakteristieken signalen van Chitosan en PVA polymeren werden gedetecteerd: bij 3286cm-1 de stretching vibratie modus van PVA hydroxylgroep groep (-Oh) en bij 2918cm-1 de stretching vibratie modus van-CH groep26,27. De signalen van amide groepen, representatief voor Chitosan structuur, werden gevonden op 1652 cm-1 aan de stretching vibratie modus van C = O (amide I), bij 1560 cm-1 aan de buig modus van N-H (amide II) en 1325 cm-1 aan de trilling van amide III28,29,30. Andere signalen, bij 1418 cm-1 tot de buig modus van de c-H en bij 1086 cm-1 tot de stretching vibratie modus van c-O groepen, beide van PVA, werden gevonden27,31,32.
Elektronische microscopie
Alle CS-PVA-hydrogels toonden een zeer poreus oppervlak (Figuur 3, van links naar rechts) en kenmerkende veranderingen werden waargenomen volgens de bereidingscondities. Hydrogels bereid bij-4 °C (CP4-4) presenteerde grotere poriën dan de hydrogels bereid bij-80 °C (CP4-80). Bovendien lijkt de laatste een meer poreus netwerk te hebben. Dit effect kan te wijten zijn aan het feit dat, bij lagere temperatuur, de water kristalvorming sneller was en veel kleine kristallen ontstonden en werden gesublimeerd tijdens het Vries droogproces, waardoor ongeldige poriën14,33. Ondertussen lijkt het effect van het aantal Vries cycli meer gedefinieerde en circulaire poriën te bevorderen in hydrogels CP6-80 (Figuur 3, van boven naar beneden).
Porosimetrie
Monsters CP4-4, CP4-80 en CP6-80 gepresenteerd meer uitgesproken veranderingen; om de informatie over de morfologie aan te vullen, werden ze geanalyseerd door MIP (tabel 1). De vergelijking tussen hydrogels CP4-4 en CP4-80 (Figuur 3a) toonde aan dat hydrogels bij een lagere temperatuur van bevriezing een meer poreus netwerk ontwikkelden, dat een groot totaal inbraak volume en een hoger totaal porie gebied presenteerde. Echter, hydrogels CP6-80 toonde minder permeabiliteit dan CP4-80 (Figuur 3b), waarschijnlijk als gevolg van hun hoge tortuheid, die ook werd weerspiegeld in een lagere totale inbraak volume. Figuur 3 presenteert de verschillende poriegroottes van deze hydrogels. Twee porie maten werden onderscheiden, een tussen 0,3-5,0 μm en andere tussen 5,0-30 μm. In hydrogels CP4-80 en CP6-80, het poreuze netwerk had een groter aantal kleine poriën dan grote, in vergelijking met CP4-4 hydrogel. Deze resultaten waren vergelijkbaar met die waargenomen door SEM-micro grafieken en suggereerden dat bij lagere temperaturen grotere interacties tussen de PVA-ketens werden begunstigd en er meer kristallijne zones werden gevormd. Zo werd de vorming van kristallijne zones door PVA-ketens gestimuleerd bij lage temperatuur.
Zwelling assays
Het zwelling gedrag van CS-PVA hydrogels is te zien in de Figuur 4. Ze snel geabsorbeerd grote hoeveelheden water; gedurende de eerste 5 uur behouden ze 10x hun gewicht, en na 20 uur behouden ze tot 15x hun gewicht (evenwichtspunt). Echter, met betrekking tot hydrogels die op hetzelfde aantal Vries cycli zijn bereid, vertoonde de hydrogel CP4-80 in de eerste 5 uur minder zwelling capaciteit als gevolg van de temperatuur die werd gebruikt voor de bereiding (-80 °C). In het geval van hydrogels bereid op verschillende aantal Vries cycli (CP4-80, CP5-80 en CP6-80) geen verschillen werden gevonden op elk moment. Waarschijnlijk, de verminderde zwelling capaciteit waargenomen in hydrogels bereid bij-80 ° c werd veroorzaakt door de kleine poriegrootte van het hydrogel-netwerk.
Drug laden en vrijgeven
Om de capaciteit van CS-PVA-hydrogels te evalueren als systemen voor de afgifte van geneesmiddelen, werd het anti-inflammatoire geneesmiddel bifenylstructuur in het netwerk geladen en vervolgens vrijgegeven. De inkapings efficiëntie (EE) in al deze systemen bedroeg ongeveer 70%; echter, de CP4-80 hydrogel presenteerde meer licht EE bij 73% (tabel 2). Ondertussen werden de vrijkomende kinetiek van bifenylstructuur uit de CS-PVA-hydrogels in alle gevallen gehandhaafd voor ongeveer 30 uur. De CP4-80 hydrogel vrijgegeven de hoogste hoeveelheid bifenylstructuur (Figuur 5). Dit kan te wijten zijn aan het feit dat deze hydrogel een meer poreuze structuur toonde in vergelijking met de andere twee soorten hydrogel. Deze functie kon de kleine molecule van drug gemakkelijk in te voeren in het hydrogel-netwerk en vervolgens, worden vrijgegeven. Tussen CP4-80 en CP6-80 hydrogels niet verschillen werden waargenomen tijdens de release tijden (Figuur 6). Er werd geen burst -effect waargenomen in een van de CS-PVA-hydrogels, wat veelbelovend is voor farmaceutische toepassingen. Wiskundige modellen werden gebruikt om het hoofdontgrendelings mechanisme in CS-PVA hydrogels te bepalen. De resultaten werden aangepast aan verschillende wiskundige modellen (tabel 3) en volgens de n -waarden werd vastgesteld dat de Fick-diffusie het proces van het vrijgeven van geneesmiddelen domineert.
Figuur 1: Chemische structuur van PVA (a), Chitosan (b) en diflunisaal (c). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: FT-IR spectra van pure Chitosan en PVA en Chitosan-PVA hydrogels bereid in verschillende omstandigheden van bevriezing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: SEM micro grafieken van Chitosan-PVA hydrogels bij 1500x vergroting. Poriegrootte verdelingen van Chitosan-PVA hydrogels: a) hydrogels bereid met 4 cycli bevriezing en bij-4 °c en-80 °c. b) hydrogels bereid bij-80 °c en, 4 en 6 cycli. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Zwelling kinetiek van Chitosan-PVA hydrogels: a) hydrogels met 4 cycli bevriezing en b) hydrogels bereid bij-80 °c. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Diflunisale vrijgave profielen in mg (a) en MT/
(b) voor hydrogels CP4-4 en CP4-80. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Diflunisale vrijgave profielen in mg (a) en MT/ (b) voor hydrogels CP4-80 en CP6-80. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Hydrogel | Totaal inbraak volume (mL/g) | Totaal porie gebied (m2/g) | Porositeit (%) | Permeabiliteit (mdarcy) | Infant |
| CP4-4 | 5,16 | 10,19 | 67,13 | 132,43 | 10,46 |
| CP4-80 | 7,36 | 15,14 | 85,95 | 151,16 | 5,83 |
| CP6-80 | 6,69 | 12,86 | 84,82 | 129,28 | 12,2 |
Tabel 1: Porosimetrie parameters van de poreuze structuur van Chitosan-PVA hydrogels.
| Monster | Diflunisal geladen | Diflunisal uitgebracht | |
| mg/g hydrogel | Inkapings efficiëntie (%) | % vrijgegeven ten opzichte van geladen | |
| CP4-4 | 3,05 ± 0,09 | 71 | 79 ± 3,33 |
| CP4-80 | 3,22 ± 0,47 | 73 | 86 ± 0,4 |
| CP6-80 | 3,19 ± 0,05 | 68 | 80 ± 3,9 |
Tabel 2: Inkapings-en vrijgave-efficiëntie voor Chitosan-PVA hydrogels.
| Monster | Korsmeyer-Peppas | Higuchi | Eerste bestelling | Nulorder | |||||
| kKP x 102 | N | R2 | kH x 102 | R2 | k1 x 102 | R2 | k0 x 102 | R2 | |
| (min-n) | (min-0,5) | (min-1) | (min-1) | ||||||
| CP4-4 | 4,3 ± 0,39 | 0,44 ± 0,02 | 0,99 | 3,1 ± 0,1 | 0,98 | 0,29 ± 0,03 | 0,803 | 0,18 ± 0,02 | 0,54 |
| CP4-80 | 3,6 ± 0,33 | 0,50 ± 0,02 | 0,99 | 3,7 ± 0,1 | 0,99 | 0,42 ± 0,03 | 0,894 | 0,27 ± 0,02 | 0,7 |
| CP6-80 | 2,3 ± 0,24 | 0,54 ± 0,02 | 0,99 | 2,9 ± 0,1 | 0,99 | 0,27 ± 0,02 | 0,925 | 0,17 ± 0,01 | 0,77 |
| k= kinetische constante; n= diffusie constante. | |||||||||
Tabel 3: Kinetische parameters van diflunisale afgifte van Chitosan-PVA hydrogels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Freeze-Thawing-methode is een geschikt proces om biocompatibele hydrogels te bereiden die zich concentreren op biomedische, farmaceutische of cosmetische toepassingen34,35,36. Het belangrijkste voordeel van deze methode, in vergelijking met andere bekende methoden om hydrogels voor te bereiden, is dat crosslinking-agent gebruik wordt vermeden, wat een ontstekingsreactie of nadelige effecten in het menselijk lichaam kan veroorzaken34. Dit is een veelzijdige methode omdat het de mogelijkheid biedt om hydrogels van PVA of hun mengsels met verschillende polymeren11,37 op zodanige wijze te bereiden dat nieuwe eigenschappen van de andere polymeren in het nieuwe materiaal kunnen worden verkregen (bijv. grote capaciteit om water te absorberen, antimicrobiële of antioxiderende eigenschappen2,18,35). Het is echter belangrijk te bedenken dat de opname van andere polymeren de sterkte van de hydrogels19,37kan verminderen.
De belangrijkste parameters die in de Vries methode moeten worden overwogen, zijn de temperatuur van het vriespunt, de tijd en het aantal Vries cycli, en ook de polymeer verhouding (in het geval van polymeer mengsels)2,19,20. Een breed scala aan zwelling, morfologische en mechanische eigenschappen kan worden verkregen met deze methode wanneer de Vries condities worden gecontroleerd. Deze parameters zijn rechtstreeks van invloed op de driedimensionale netwerkconfiguratie in Chitosan-PVA hydrogels, omdat de Vries condities de regelingen in PVA-ketens bevorderen, die worden samengevoegd door fysieke interacties, de zogenaamde kristallijne zones12,38. Deze kristallijne zones zijn geconcentreerde gebieden van waterstofbindingen die fungeren als kruiskoppelings punten in de hydrogels, die het driedimensionale netwerk onderhouden en vormen en het is een oprolmechanisme wanneer hydrogels in de zwelling staat2,39,40.
In deze studie evalueerden we het effect van een nieuw bereik van vries-dooi temperaturen (-4 °C,-20 °C en-80 °C) in combinatie met een verschillend aantal Vries cycli (4, 5 en 6) maar hetzelfde moment van bevriezing (20 uur), om 1:1 Chitosan-PVA-hydrogels voor te bereiden. De laagste zwelling capaciteit werd waargenomen bij de laagste temperatuur (-80 °C). Inderdaad, hydrogels bij deze laagste temperatuur verkregen de kleinere poriën en de meer poreuze netwerken. Deze verschillen in Chitosan-PVA-hydrogels zijn nuttig voor verschillende toepassingen, zoals systemen voor het afleveren van geneesmiddelen of steigers. In het algemeen, Chitosan-PVA hydrogels presenteren hoge frequenties van zwelling, als gevolg van Chitosan hydrofiele groepen (-NH2)41,42, en ze zijn zacht, flexibel, gemakkelijk te hanteren en weerstaan aan de manipulatie vanwege PVA kenmerken. In die zin is de Freeze-Thawing-methode gemakkelijk, goedkoop en snel om Chitosan-PVA-hydrogels met verschillende eigenschappen te produceren, waardoor toxische crosslinking wordt vermeden.
Hoewel de Freeze-Thawing een eenvoudige en vriendelijke methode is, heeft het een aantal nadelen. Een volledige homogenisatie van Chitosan, in dit geval, en van de polymeer mengsels is erg belangrijk. Hydrogels kunnen kwetsbaarder zones en een onregelmatige poreuze structuur presenteren. Ook is het noodzakelijk om een juiste ontbinding van PVA in water te maken door verwarming bij 70-80 °c42,43 voor 1 uur onder magnetisch roeren. De koeling van deze PVA-oplossing moet traag zijn met constant roeren om de vorming van een massieve laag PVA te voorkomen.
Een beperking van deze methode, voor celkweek testen, is de vorming van witachtige of semi-transparante hydrogels. In dit geval kan de toepassing van glycerol of DMSO (toxische verbinding bij kamertemperatuur) worden gebruikt om het uiterlijk van hydrogel23,44te verbeteren. De vriesdroog stap van de Vries-Thawing-methode om CS-PVA-hydrogels voor te bereiden is een kritieke stap, omdat de hydrogels een vernauwing in de middelste zone konden presenteren, wat het werk en de karakterisering compliceren. Om dit te voorkomen, moet het monster volledig bevroren worden gehouden vóór lyofilisatie. Met betrekking tot de drug laden en release studies, het is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen interferentie met de signalen van de hydrogel componenten en het geneesmiddel te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Auteurs zijn C. Luzuriaga dankbaar voor de ondersteuning in de porosimetrie metingen. Auteurs ook dank aan Ministerio de Economía y Competitividad van Spanje voor financiële ondersteuning (project MAT2014-59116-C2-2-R) en PIUNA (Ref. 2018-15). De auteurs willen ook Dr. Amir Maldonado van Departamento de física-UNISON erkennen voor ondersteuning en nuttige commentaren en Dr. SE Burruel-Ibarra van DIPM-UNISON voor SEM images en Rubio Pharma y Asociados S. A. de C. V. voor financiële ondersteuning. ME Martínez-Barbosa wil CONACyT (México) projecten No. 104931 en No. 256753 bedanken, naast de financiële steun van Red Temática de Nanociencias y Nanotecnología del programa de redes Temáticas del CONACyT. En ook project USO316001081. MD Figueroa-Pizano wil CONACyT graag erkennen voor financiële steun (studiebeurs 373321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| Chitosan medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70% |
| Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid) | Merck | ||
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 1005706 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 341584 | Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed |
| Equipment: | |||
| Cressington Sputter Coater 108 auto | TED PELLA INC | ||
| Cryodos Lyophilizator | Telstar | ||
| Falcon tubes | Thermo Fisher Company | ||
| FT-IR spectroscopy | Nicolet iS50 | in ATR mode | |
| Lyophilizator | LABCONCO | ||
| Micromeritics Autopore IV 9500 | Micromeritics | ||
| Scanning electron microscope | Pemtron SS-300LV | ||
| UV-visible spectrophotometer | Agilent 8453 |
References
- Gyles, D. A., Castro, L. D., Silva, J. O. C., Ribeiro-Costa, R. M. A review of the designs and prominent biomedical advances of natural and synthetic hydrogel formulations. European Polymer Journal. 88 (01), 373-392 (2017).
- Abdel-Mohsen, aM., Aly, aS., Hrdina, R., Montaser, aS., Hebeish, a Eco-Synthesis of PVA/Chitosan Hydrogels for Biomedical Application. Journal of Polymers and the Environment. 19, 1005-1012 (2011).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. European Polymer Journal. 65, 252-267 (2015).
- Ahmadi, F., Oveisi, Z., Samani, M., Amoozgar, Z. Chitosan based hydrogels: Characteristics and pharmaceutical applications. Research in Pharmaceutical Sciences. 10 (1), 1-16 (2015).
- Siepmann, J., Siegel, R. A., Rathbone, M. J. Fundamentals and applications of controlled release drug delivery. Fundamentals and Applications of Controlled Release Drug Delivery. , (2012).
- Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, O. G. Hydrogels: Methods of Preparation, Characterisation and Applications. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications. , 117-146 (2011).
- Ahmed, E. M. Hydrogel: Preparation, characterization, and applications. Journal of Advanced Research. 6 (2), 105-121 (2015).
- Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sensors and Actuators, B: Chemical. 147 (2), 765-774 (2010).
- Patel, A., Mequanint, K.
- Kenawy, E., Kamoun, E. A., El-meligy, M. A., Mohy, M. S. Physically crosslinked poly ( vinyl alcohol ) - hydroxyethyl starch blend hydrogel membranes Synthesis and characterization for biomedical applications. Arabian Journal of Chemistry. 7 (3), 372-380 (2014).
- Kamoun, E. A., Kenawy, E. R. S., Chen, X. A review on polymeric hydrogel membranes for wound dressing applications: PVA-based hydrogel dressings. Journal of Advanced Research. 8 (3), 217-233 (2017).
- Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Morphology of Freeze / Thawed PVA Hydrogels. Macromolecules. 33, 2472-2479 (2000).
- Tsou, Y. H., Khoneisser, J., Huang, P. C., Xu, X. Hydrogel as a bioactive material to regulate stem cell fate. Bioactive Materials. 1 (1), 39-55 (2016).
- Kumar, A., Mishra, R., Reinwald, Y., Bhat, S. Cryogels: Freezing unveiled by thawing. Materials Today. 13 (11), 42-44 (2010).
- Wu, T., Li, Y., Lee, D. S. Chitosan-based composite hydrogels for biomedical applications. Macromolecular Research. 25 (6), 480-488 (2017).
- Dutta, P. K., Dutta, J., Tripathi, V. S. Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications. Journal of Scientific and Industrial Research. 63, 20-31 (2004).
- Szymańska, E., Winnicka, K. Stability of Chitosan—A Challenge for Pharmaceutical and Biomedical Applications. Marine Drugs. 13, 1819-1846 (2015).
- Yang, X., Liu, Q., Chen, X., Yu, F., Zhu, Z. Investigation of PVA/ws-chitosan hydrogels prepared by combined gamma-irradiation and freeze-thawing. Carbohydrate Polymers. 73 (3), 401-408 (2008).
- Mathews, D. T., Birbey, Y. A., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Mechanical and Morphological Characteristics of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan Hydrogels. Journal of Applied Polymer Science. 109, 1129-1137 (2008).
- Hosseini, M. S., Amjadi, I., Haghighipour, N. Preparation of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan-Blended Hydrogels: Properties, in Vitro Studies and Kinetic Evaluation. Journal of Biomimetics, Biomaterials, and Tissue Engineering. 15, 63-72 (2012).
- Afshari, M. J., Sheikh, N., Afarideh, H. PVA/CM-chitosan/honey hydrogels prepared by using the combined technique of irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 113, 28-35 (2015).
- Agnihotri, S., Mukherji, S. S., Mukherji, S. S. Antimicrobial chitosan-PVA hydrogel as a nanoreactor and immobilizing matrix for silver nanoparticles. Applied Nanoscience. 2 (3), 179-188 (2012).
- Yang, X., et al. Cytotoxicity and wound healing properties of PVA/ws-chitosan/glycerol hydrogels made by irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 79 (5), 606-611 (2010).
- Machín, R., Isasi, J. R., Vélaz, I. Hydrogel matrices containing single and mixed natural cyclodextrins. Mechanisms of drug release. European Polymer Journal. 49 (12), 3912-3920 (2013).
- Ritger, P. L., Peppas, N. A. A Simple Equation for Description of Solute Release. Journal of Controlled Release. 5, 37-42 (1987).
- Abureesh, M. A., Oladipo, A. A., Gazi, M. Facile synthesis of glucose-sensitive chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogel: Drug release optimization and swelling properties. International Journal of Biological Macromolecules. 90, 75-80 (2016).
- Mansur, H. S., Sadahira, C. M., Souza, A. N., Mansur, A. A. P. FTIR spectroscopy characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogel with different hydrolysis degree and chemically crosslinked with glutaraldehyde. Materials Science and Engineering C. 28 (4), 539-548 (2008).
- Parida, U. K., Nayak, A. K., Binhani, B. K., Nayak, P. L. Synthesis and Characterization of Chitosan-Polyvinyl Alcohol Blended with Cloisite 30B for Controlled Release of the Anticancer Drug Curcumin. Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. 02 (04), 414-425 (2011).
- Zu, Y., et al. Preparation and characterization of chitosan-polyvinyl alcohol blend hydrogels for the controlled release of nano-insulin. International Journal of Biological Macromolecules. 50 (1), 82-87 (2012).
- Lejardi, A., Hernández, R., Criado, M., Santos, J. I., Etxeberria, A., Sarasua, J. R. Novel hydrogels of chitosan and poly ( vinyl alcohol ) -g-glycolic acid copolymer with enhanced rheological properties. Carbohydrate Polymers. , 267-273 (2014).
- dos Reis, E. F., et al. Synthesis and characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogels and hybrids for rMPB70 protein adsorption. Materials Research. 9 (2), 185-191 (2006).
- Thanyacharoen, T., Chuysinuan, P., Techasakul, S., Nooeaid, P., Ummartyotin, S. Development of a gallic acid-loaded chitosan and polyvinyl alcohol hydrogel composite: Release characteristics and antioxidant activity. International Journal of Biological Macromolecules. 107, 363-370 (2018).
- Lozinsky, V. I., et al. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. Trends in Biotechnology. 21 (10), 445-451 (2003).
- Liu, Y., Vrana, N. E., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Physically crosslinked composite hydrogels of PVA with natural macromolecules: Structure, mechanical properties, and endothelial cell compatibility. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 90 (2), 492-502 (2009).
- Yang, W., et al. Polyvinyl alcohol/chitosan hydrogels with enhanced antioxidant and antibacterial properties induced by lignin nanoparticles. Carbohydrate Polymers. 181 (August 2017), 275-284 (2018).
- Park, H., Kim, D. Swelling and mechanical properties of glycol chitosan/poly(vinyl alcohol) IPN-type superporous hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 78 (4), 662-667 (2006).
- Zhang, H., Zhang, F., Wu, J. Physically crosslinked hydrogels from polysaccharides prepared by freeze-thaw technique. Reactive and Functional Polymers. 73 (7), 923-928 (2013).
- Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Applications of Poly ( vinyl alcohol ) Hydrogels Produced by Conventional Crosslinking or by Freezing / Thawing Methods. Advances in Polymer Science. 153, 37-65 (2000).
- Sung, J. H., et al. Gel characterisation and in vivo evaluation of minocycline-loaded wound dressing with enhanced wound healing using polyvinyl alcohol and chitosan. International Journal of Pharmaceutics. 392 (1-2), 232-240 (2010).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: Network design and mathematical modeling. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (12-13), 1379-1408 (2006).
- Fan, L., Yang, H., Yang, J., Peng, M., Hu, J. Preparation and characterization of chitosan/gelatin/PVA hydrogel for wound dressings. Carbohydrate Polymers. 146, 427-434 (2016).
- Islam, A., et al. Evaluation of selected properties of biocompatible chitosan / poly ( vinyl alcohol) blends. International Journal of Biological Macromolecules. 82, 551-556 (2016).
- Physical Montaser, A. S. mechanical and antimicrobial evaluations of physically crosslinked PVA/chitosan hydrogels containing nanoparticles. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 6 (5), 1-6 (2016).
- Hou, Y., Chen, C., Liu, K., Tu, Y., Zhang, L., Li, Y. Preparation of PVA hydrogel with high-transparence and investigations of its transparent mechanism. RSC Advances. 5 (31), 24023-24030 (2015).
