Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nahezu infrarote Farbstoffe in Verbindung mit Immunhistochemie und hochauflösendem Scannen verwendet, um Proteine in Hirnregionen zu untersuchen.
Abstract
Neurowissenschaften ist die Studie, wie Zellen im Gehirn verschiedene Funktionen vermitteln. Die Messung der Proteinexpression in Neuronen und Glia ist für die Erforschung der Neurowissenschaft von entscheidender Bedeutung, da die zelluläre Funktion durch die Zusammensetzung und Aktivität zellulärer Proteine bestimmt wird. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Immunozytochemie mit dem Infrarot-hochauflösenden Scannen kombiniert werden kann, um eine halbquantitative Messung der Proteinexpression in unterschiedlichen Hirnregionen zu ermöglichen. Diese Technik kann für den Einzel-oder Doppelproteinausdruck in der gleichen Hirnregion verwendet werden. Die Messung von Proteinen auf diese Weise kann verwendet werden, um eine relative Veränderung des Proteinausdrucks mit einer experimentellen Manipulation, molekularer Signatur von Lernen und Gedächtnis, Aktivität in molekularen Wegen und neuronale Aktivität in mehreren Hirnregionen zu erreichen. Mit den richtigen Proteinen und statistischen Analysen kann auch die funktionelle Konnektivität zwischen Hirnregionen ermittelt werden. Angesichts der Leichtigkeit der Einführung der Immunozytochemie in einem Labor, die Verwendung von Immunozytochemie mit nahezu infraroten hochauflösenden Scannen kann die Fähigkeit der Neurowissenschaftler, neurobiologische Prozesse auf einer Systemebene zu untersuchen zu erweitern.
Introduction
Die Studie der Neurowissenschaften betrifft eine Untersuchung, wie Zellen im Gehirnbestimmte Funktionen 1vermitteln. Diese können zellulärer Natur sein, wie zum Beispiel, wie Gliazellen Immunität im zentralen Nervensystem gewähren oder Experimente beinhalten, die erklären sollen, wie die Aktivität von Neuronen im dorsalen Hippocampus zu einer räumlichen Navigation führt. Im weitesten Sinne wird die zelluläre Funktion durch die Proteine bestimmt, die in einer Zelle ausgedrückt werden, und dieAktivität dieser Proteine 2. Daher ist die Messung des Ausdrucks und/oder Aktivität von Proteinen in Gehirnzellen entscheidend für die Untersuchung der Neurowissenschaften.
Eine Reihe von Techniken stehen zur Verfügung, um Proteinausdruck im Gehirn zu messen. Dazu gehören in vivo-Methoden wie Positronen-Emissionstopografie für Rezeptordichten 3 und Mikrodialyse für kleine Peptide4. Häufiger werden Ex-vivo-Methoden verwendet, um Proteinfunktion und-ausdruck zu untersuchen. Dazu gehören Massenspektrometrie-Techniken 5, Western Blot und enzym-verknüpfte immunsorbierende Assay(ELISA) 6, und Immunozytochemie7. Die Immunozytochemie ist im Bereich der Neurowissenschaften weit verbreitet. Bei dieser Technik wird ein primärer Antikörper verwendet, um ein Protein (oder Antigen) von Interesse zu erkennen (z.B. c-Fos) und einen konjugierten sekundären Antikörper, um den Protein-primären Antikörper-Komplex zu erkennen (Abbildung1). Um den Nachweis des protein-primären Antikörper-Sekundarkkomplexes zu ermöglichen, haben sekundäre Antikörper oxidierende Substanzen wie Meerrettiche Peroxidase (HRP), die ihnen konjugiert werden. Dies ermöglicht die Bildung von Niederschlägen in Zellen, die mit Lichtmikroskopie7erkannt werden können. Sekundäre Antikörper können auch Chemikalien haben, die fluoreszieren, um sie zu konjugieren (z.B. Fluorophore). Bei der Stimulierung stoßen diese Chemikalien Licht aus, mit dem Protein-primäre Antikörper-sekundäre Antikörper-Komplexe 7 erkannt werden können. Schließlich sind primäre Antikörper manchmal mit Reduktionsmitteln und Fluoreszenzchemikalien versehen, die direkt die Notwendigkeit von sekundären Antikörpern7 beeinträchtigen (Abbildung1).
Interessanterweise erlauben viele immunozytochemische Methoden die Visualisierung von Proteinen in Gehirnzellen, nicht aber die Fähigkeit, die Proteinmenge in einer bestimmten Zell-oder Hirnregion zu quantifizieren. Der Einsatz von Lichtmikroskopie zur Erkennung von Niederschlägen aus Reduktionsreaktionen ermöglicht die Visualisierung von Neuronen und Glia, aber diese Methode kann nicht verwendet werden, um Proteinexpression in Zellen oder in einer bestimmten Hirnregion zu quantifizieren. Theoretisch kann dafür die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, denn das Licht, das aus dem fluoreszierenden sekundären Antikörper emittiert wird, ist ein Maß für den proteinprimären Antikörper-Sekundenkomplex. Die Autofluoreszenz im Hirngewebe kann es jedoch schwierig machen, mit der Fluoreszenzmikroskopie die Proteinexpression im Hirngewebe 8zuquantifizieren. Daher wird Licht, das aus fluoreszierenden Bildern von Hirngewebe emittiert wird, nur selten zur Quantifizierung des Proteinausdrucks im Gehirn verwendet.
Viele dieser Probleme können mit Hilfe der Infrarot-Immunozytochemie in Verbindung mit hochauflösenden Scannenvon 9,10angegangenwerden. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Immunozytochemie in Verbindung mit Fluorophoren in den nahezu infrarotfarbenen Emissionsspektren mit hochauflösenden Scannen (z.B. 10 – 21 μm) kombiniert werden kann, um scharfe Bilder zu erhalten, die eine Halbquantifizierung des Proteins in unterschiedlichen Hirnregionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Artikel vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die nahezu infrarote Immunozytochemie in Kombination mit hochauflösendem Scannen genutzt werden kann, um semiquantitative Maßnahmen der Proteinexpression im Hirngewebe zu erhalten. Es kann auch verwendet werden, um zwei Proteine gleichzeitig in der gleichen Hirnregion zu kennzeichnen. Wir haben zuvor die Infrarot-Immunhistochemie verwendet, um die sofortige frühe Genexpression in mehreren Hirnregionen9,10zu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung in diesem Bericht wurde durch ein Zielzuschuss der NIGMS (1P20GM103653) an DK finanziert.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
Riferimenti
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