Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen
Summary
Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.
Abstract
Het ubiquitin-proteasome-systeem is een belangrijke regulator van eiwit degradatie en een verscheidenheid aan andere cellulaire processen in eukaryoten. In de hersenen, stijgingen van de activiteit van ubiquitin-proteasome zijn van cruciaal belang voor synaptische plasticiteit en Geheugenvorming en afwijkende veranderingen in dit systeem zijn geassocieerd met een verscheidenheid van neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische stoornissen. Een van de problemen bij het bestuderen van ubiquitin-proteasome functioneren in de hersenen is dat het aanwezig is in alle cellulaire compartimenten, waarin de eiwit doelen, functionele rol en mechanismen van regulering sterk kunnen variëren. Als gevolg daarvan is de mogelijkheid om de hersenen ubiquitine eiwit targeting en proteasoom katalytische activiteit in verschillende subcellulaire compartimenten binnen hetzelfde dier direct te vergelijken, essentieel om volledig te begrijpen hoe de ups bijdraagt aan synaptische plasticiteit, geheugen en ziekte. De hier beschreven methode maakt verzameling van nucleaire, cytoplasmatische en ruwe synaptische fracties van dezelfde knaagdier (rat) hersenen, gevolgd door gelijktijdige kwantificering van proteasoom katalytische activiteit (indirect, het verstrekken van activiteit van de proteasoom kern alleen) en koppelings specifieke ubiquitine-eiwit tagging. Zo, de methode kan worden gebruikt om direct te vergelijken subcellulaire veranderingen in ubiquitin-proteasome activiteit in verschillende hersengebieden in hetzelfde dier tijdens synaptische plasticiteit, Geheugenvorming en verschillende ziektetoestanden. Deze methode kan ook worden gebruikt om de subcellulaire verdeling en functie van andere eiwitten binnen hetzelfde dier te beoordelen.
Introduction
Het ubiquitin-proteasome systeem (UPS) is een complex netwerk van onderling verbonden eiwit structuren en ligasen die de afbraak van de meeste kortstondige eiwitten in de cellen1regelt. In dit systeem, eiwitten zijn gemarkeerd voor afbraak of andere cellulaire processen/Fates door de kleine modifier ubiquitin. Een doeleiwit kan 1-7 ubiquitine-modificaties verwerven, die samen kunnen linken op een van de zeven lysine (K)-sites (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63) of de N-terminale methionine (M1; zoals lineair genoemd) in de vorige ubiquitine2. Sommige van deze polyubiquitin Tags zijn afbraak-specifieke (K48)3, terwijl anderen zijn grotendeels onafhankelijk van het eiwitafbraak proces (M1)4,5,6. Zo is het eiwit Ubiquitination proces ongelooflijk complex en het vermogen om veranderingen in een specifieke polyubiquitin-tag te kwantificeren is van cruciaal belang om uiteindelijk de rol van die gegeven modificatie in cellulaire werking te begrijpen. Door de studie van dit systeem verder te compliceren, is het proteasome, dat de katalytische structuur van de ups7is, beide eiwitten degradeert, maar kan het ook worden betrokken bij andere niet-Proteolytische processen8,9. Niet verrassend dan, sinds de eerste ontdekking, normale en afwijkende ubiquitin-proteasome activiteit is betrokken bij de lange-termijn Geheugenvorming en een verscheidenheid van ziektetoestanden, met inbegrip van vele neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische aandoeningen10,11. Als gevolg hiervan zijn methoden die effectief en efficiënt de activiteit van UPS in de hersenen kunnen kwantificeren essentieel om uiteindelijk te begrijpen hoe dit systeem wordt ontregeld in ziektetoestanden en de uiteindelijke ontwikkeling van behandelingsopties die gericht zijn op ubiquitine en/of proteasoom functioneren.
Er zijn een aantal problemen bij het kwantificeren van ubiquitine-proteasome activiteit in hersenweefsel van ratten en muizen, de meest voorkomende modelsystemen die worden gebruikt om de UPS-functie te bestuderen, waaronder 1) de diversiteit van ubiquitine-modificaties, en 2) distributie en differentiële regulering van ups die in subcellulaire compartimenten12,13en14functioneren. Bijvoorbeeld, veel van de vroege demonstraties van ubiquitin-proteasoom functie in de hersenen tijdens Geheugenvorming gebruikt hele celllysates en aangegeven tijdafhankelijke verhogingen in beide eiwit Ubiquitination en proteasoom activiteit15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. we vonden echter onlangs dat ubiquitin-proteasome-activiteit sterk varieerde over subcellulaire compartimenten in reactie op leren, met gelijktijdige stijgingen in sommige regio’s en dalingen in andere, een patroon dat aanzienlijk verschilt van wat eerder werd gerapporteerd in de hele cel eiwitlysaten21. Dit is in overeenstemming met de beperking van een hele celbenadering, omdat het de bijdrage van veranderingen in de UPS-activiteit in verschillende subcellulaire compartimenten niet kan ontkoppelen. Hoewel meer recente studies hebben gebruikt synaptische fractie protocollen voor het bestuderen van de ups specifiek op synapsen in reactie op het leren van22,23,24, de gebruikte methoden occlude de mogelijkheid om te meten nucleaire en cytoplasmische ubiquitine-proteasome veranderingen in hetzelfde dier. Dit resulteert in een onnodige noodzaak om experimenten meerdere malen herhalen, het verzamelen van een andere subcellulaire Fractie in elk. Dit resulteert niet alleen in een groter verlies van dier levens, maar elimineert de mogelijkheid om de UPS-activiteit direct te vergelijken met verschillende subcellulaire compartimenten in reactie op een bepaalde gebeurtenis of tijdens een specifieke ziektestatus. Gezien het feit dat eiwit doelen van ubiquitine en het proteasoom sterk variëren in de cel, begrijpen hoe ubiquitine-proteasoom signalering verschilt in verschillende subcellulaire compartimenten is essentieel voor het identificeren van de functionele rol van de ups in de hersenen tijdens Geheugenvorming en neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische stoornissen.
Om deze behoefte aan te pakken, hebben we onlangs een procedure ontwikkeld waarin nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties kunnen worden verzameld voor een bepaald hersengebied van hetzelfde dier21. Om rekening te houden met de beperkte hoeveelheid eiwitten die kan worden verkregen uit het verzamelen van meerdere subcellulaire fracties uit hetzelfde monster, hebben we eerder vastgestelde protocollen geoptimaliseerd om in vitro proteasoom activiteit en koppelings-specifieke eiwit ubiquitinatie in gelyseerd cellen verzameld uit knaagdier hersenweefsel. Met behulp van dit protocol, we waren in staat om te verzamelen en direct te vergelijken leer afhankelijke veranderingen in proteasoom activiteit, K48, K63, M1 en algehele eiwit polyubiquitination niveaus in de Nucleus en cytoplasma en bij synapsen in de laterale amygdala van ratten. Hier beschrijven we in detail onze procedure (Figuur 1), die ons begrip van hoe de ups betrokken is bij de lange termijn Geheugenvorming en verschillende ziektetoestanden aanzienlijk zou kunnen verbeteren. Echter, opgemerkt moet worden dat de in vitro proteasoom activiteit die in ons protocol wordt besproken, terwijl op grote schaal gebruikt, niet direct de activiteit van complete 26s proteasoom complexen meet. Eerder, deze bepaling meet de activiteit van de kern van de 20s, wat betekent dat het kan alleen dienen als een volmacht om te begrijpen van de activiteit van de kern zelf in tegenstelling tot de gehele 26s proteasoom complex.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier tonen we een efficiënte methode voor het kwantificeren van veranderingen in ubiquitin-proteasome activiteit over verschillende subcellulaire compartimenten in hetzelfde dier. Momenteel zijn de meeste pogingen om subcellulaire veranderingen in activiteit van het ubiquitin-proteasome systeem te meten beperkt tot één compartiment per monster, wat resulteerde in de noodzaak om experimenten te herhalen. Dit leidt tot aanzienlijke kosten en verlies van dierlijk leven. Ons protocol lost dit probleem op door hemisferen t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Startup funds van het College of landbouw en Life Sciences en het College of Science bij Virginia Tech. T.M. wordt ondersteund door het George Washington Carver-programma van Virginia Tech.
Materials
| 0.5M EDTA | Fisher | 15575020 | Various other vendors |
| 20S Proteasome Activity Kit | Millipore Sigma | APT280 | Other vendors carry different versions |
| ATP | Fisher | FERR1441 | Various other vendors |
| Beta-actin antibody | Cell signaling | 4967S | Various other vendors |
| Beta-tubulin antibody | Cell signaling | 2128T | Various other vendors |
| BioTek Synergy H1 plate reader | BioTek | VATECHH1MT3 | Other vendors carry different versions |
| B-mercaptoethanol | Fisher | ICN19024280 | Various other vendors |
| clasto lactacystin b-lactone | Millipore Sigma | L7035 | Various other vendors |
| Cryogenic cup | Fisher | 033377B | Various other vendors |
| DMSO | DMSO | D8418 | Varous other vendors |
| DTT | Millipore Sigma | D0632 | Various other vendors |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | Various other vendors |
| H3 antibody | Abcam | ab1791 | Various other vendors |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Various other vendors |
| Hydrochloric acid | Fisher | SA48 | Various other vendors |
| IGEPAL (NP-40) | Millipore Sigma | I3021 | Various other vendors |
| K48 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab140601 | Various other vendors |
| K63 Ubiquitin Antibody | Abcam | ab179434 | Various other vendors |
| KCl | Millipore Sigma | P9541 | Various other vendors |
| KONTES tissue grinder | VWR | KT885300-0002 | Various other vendors |
| Laemmli sample buffer | Bio-rad | 161-0737 | Various other vendors |
| Linear Ubiquitin Antibody | Life Sensors | AB-0130-0100 | Only M1 antibody |
| MgCl | Millipore Sigma | 442611 | Various other vendors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 2231000213 | Various other manufacturers/models |
| myr-AIP | Enzo Life Sciences | BML-P212-0500 | Carried by Millipore-Sigma |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Various other vendors |
| Odyssey Fc Imaging System | LiCor | 2800-02 | Other vendors carry different versions |
| Phosphatase Inhibitor | Millipore Sigma | 524625 | Various other vendors |
| Precision Plus Protein Standard | Bio-rad | 161-0373 | Various other vendors |
| Protease Inhibitor | Millipore Sigma | P8340 | Various other vendors |
| PSD95 antibody | Cell signaling | 3450T | Various other vendors |
| SDS | Millipore Sigma | L3771 | Various other vendors |
| Sodium hydroxide | Fisher | SS255 | Various other vendors |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | Various other vendors |
| TBS | Alfa Aesar | J62938 | Varous other vendors |
| Tris | Millipore Sigma | T1503 | Various other vendors |
| Tween-20 | Fisher | BP337-100 | Various other vendors |
| Ubiquitin Antibody | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | Various other vendors |
Riferimenti
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
- Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
- Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
- Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
- Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
- Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
- Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
- Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
- Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
- Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
- Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
- Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
- Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
- Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
- Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
- Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
- Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
- Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
- Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
- Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).
