Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung von Hirnverletzungen, Bewegungsdefiziten und Neuroentzündungen nach Blutungen im Gehirn in Zebrafisch-Larven vor, im Zusammenhang mit der menschlichen intrazerebralen Blutung (ICH).
Obwohl es sich um die schwerste Subsorte des Schlaganfalls mit hoher globaler Sterblichkeit handelt, gibt es keine spezifische Behandlung für Patienten mit intrazerebraler Blutung (ICH). Die Modellierung von ICH vorklinisch hat sich als schwierig erwiesen, und aktuelle Nagetiermodelle haben die Spontane des menschlichen ICH schlecht rekapitulieren können. Daher ist es dringend erforderlich, alternative präklinische Methoden für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen im ICH und für eine mögliche Arzneimittelentdeckung zu entwickeln.
Der Einsatz von Zebrafischen stellt einen immer beliebter werdenden Ansatz für die translationale Forschung dar, vor allem aufgrund einer Reihe von Vorteilen, die sie gegenüber Säugetiermodellen besitzen, einschließlich der fruchtbaren Reproduktionsraten und der Larventransparenz, die das Leben ermöglicht. Imaging. Andere Gruppen haben festgestellt, dass Zebrafisch-Larven nach genetischen oder chemischen Störungen der zerebrovaskulären Entwicklung spontane ICH ausweisen können. Ziel dieser Methodik ist es, mit solchen Modellen die pathologischen Folgen von Hirnblutungen im Rahmen der präklinischen ICH-Forschung zu untersuchen. Durch den Einsatz von Live-Bildgebungs-und Beweglichkeitsassays können Hirnschäden, Neuroentzündungen und Bewegungsapparate nach ICH bewertet und quantifiziert werden.
Diese Studie zeigt, dass die wichtigsten pathologischen Folgen der Hirnblutung beim Menschen in Zebrafisch-Larven konserviert werden, die den Modellorganismus als wertvolles In-vivo-System für die präklinische Untersuchung von ICH hervorheben. Ziel dieser Methodik ist es, die präklinische Schlaganfallgemeinschaft in die Lage zu versetzen, das Färbemodell für Zebrafische als alternatives komplementäres Modellsystem für Nagetiere einzusetzen.
Die intrakerebrale Blutung (ICH) ist die schwerste Unterart des Schlaganfalls, der mit einem spontanen Bruch des Gehirns und einer Blutung in das Parenchyma einhergeht, das zu Hirnschäden, körperlicher Behinderung und oft Tod 1 führt. Trotz der hohen Sterblichkeits-und Morbiditätsrate, die mit ICH2 verbundenist, fehlt es immer noch an Verständnis für die zugrunde liegende Ätiologie und die Pathologie nach der Blutung. Daher gibt es keine spezifischen Behandlungen, um ICH zu verhindern oder die Ergebnisse der Patienten zu verbessern. Der größte Teil unseres Verständnisses von Krankheitsbiologie stammt aus präklinischen Nagetiermodellen desICH3, jedoch haben Studien in diesen Modellen bisher kein erfolgreiches therapeutisches Therapeutikum in die Klinik4,5übersetzt. Dieses Versagen kann zum Teil auf einige Einschränkungen dieser präklinischen Modelle zurückzuführen sein, einschließlich der Unfähigkeit, die spontane Natur der menschlichen Krankheit leicht zu rekapitulieren, und die Notwendigkeit einer invasiven Chirurgie, um die Modelle bei Säugetieren 6 zu erzeugen. Darüber hinaus stellen Nagetiere praktische Probleme bei der Beobachtung des schnellen Auftretens von zellulären Reaktionen auf ICH in intaktem Gewebe dar. Angesichts des Mangels an Übersetzungen durch Nagetiermodelle ist die Entwicklung alternativer Modelle des spontanen ICH unerlässlich, wenn wir diese praktischen Probleme überwinden und dabei helfen wollen, neue Drogenziele zu identifizieren.
Die molekularen Mechanismen der Gefäßentwicklung sind unter Wirbeltieren, darunter Zebrafische (Danio rerio)7, gut erhalten. Als solche wird die Annahme dieses Modellorganismus zu einer immer nützlicheren mechanistischen Strategie für die Untersuchung von zerebrovaskulären Erkrankungen 8. Es wurden eine Reihe von Zebrafisch-Modellen entwickelt, die Phenotypen rekapitulieren, die mit Schlaganfall-bedingten Zuständen9,10,11, 12 inVerbindung stehen. Der Einsatz von Zebrafisch-Larven zur Untersuchung von Krankheitserregern bietet sowohl praktische als auch wissenschaftliche Vorteile gegenüber Säugetiermodellen 8. Dazu gehören hohe Reproduktionsraten, eine rasante Entwicklung und eine Larventransparenz, die eine intravitale Bildgebung ohne die invasiven Einschränkungen von Nagetierenermöglicht. Die Kopplung dieser Vorteile mit der breiten Palette von transgenen Reporterlinien, die in der Zebrafisch-Forschunggemeinde zur Verfügung stehen, ist ein leistungsfähiger Ansatz in vivo , um die Krankheitsbiologie zu studieren, die noch nicht für die Untersuchung der pathologischen Folgen von ICH.
Die Verletzungsreaktion auf Blut im Gehirn ist biphasic 13; Die primäre Beleidigung verursacht neuronale Todesfälle und Zellnekrosen, die dann eine sekundäre Welle von Schäden auslösen, die durch angeborene Immunaktivierung ausgelöst wird. Die zweite Phase der Hirnverletzung, insbesondere die neuroinflammatorische Komponente, gilt als realistisches Ziel für die zukünftige medikamentöse Behandlung 13. In Zebrafisch-Larven wurden zuvorzuvor 14,15,16, 17, 18,19spontane und zerebartige Blutungen beschrieben. Zwei solcher Modelle sind der Einsatz von atorvastatin (ATV) bei 24 h Post-Befruchtung (hpf), um den HMGCR-Weg und die Cholesterin-Biosynthese14zu hemmen, und ein Blasenkopf (BBh) Mutant, das eine hypomorphe Mutation im Arhgef7 -Gen ausdrückt, Und hemmt in der Folge die Aktin-Umgestaltung für enge endovaskuläre Knotenpunkte18. Diese Modelle weisen bei Beginn der Zirkulation einen spontanen zerebral-spezifischen Blutgefäßbruch auf (~ 33 hpf). In jüngster Zeit haben wir diese Modelle weiter charakterisiert, um zu zeigen, dass Schlüsselaspekte der Gehirnverletzungsreaktion zwischen Menschen und Zebrafisch-Larven 20 konserviert werden. Diese Studie zeigt die Methodik, die erforderlich ist, um spontane Hirnblutungen in Zebrafisch-Larven zu erhalten und zu visualisieren und wie man Gehirnverletzungen quantifiziert, und Bewegungsstörungen und neuroentzündliche Phenotypen, die sich auf den menschlichen Zustand beziehen. Diese Daten und Techniken unterstützen den Einsatz dieser Modellart als wertvolles Komplementärsystem für die präklinische ICH-Forschung.
Diese Studie zeigt, dass ICH in Zebrafisch-Larven eine Gehirnverletzungsreaktion hervorruft, die wesentliche Aspekte des menschlichen Zustandes rekapituliert, die systematisch untersucht und quantifiziert werden können. Zebrafische bieten ein konsistentes und reproduzierbares Modell des spontanen ICH, das bei zukünftigen Medikamenteninterventionsstudien helfen wird, die sich auf die gezielte Bekämpfungvonblutverursachten Hirnverletzungen konzentrieren, anstatt einen Gefäßbruch von17,28 zuverhindern. Angesichts des schnellen Charakters des Krankheitseintritt, der der klinischen Situation ähnelt, bietet ein solcher Ansatz spannende Perspektiven für eine erfolgreiche Umsetzung in der Zukunft.
Einige Einschränkungen sind mit der Verwendung von Zebrafisch-Larven verbunden, wie die Verwendung eines sich entwickelnden Systems und taxonomischen Ranges, aber die praktischen und wissenschaftlichen Vorteile dieses Modells müssen berücksichtigt werden, um neue Einblicke in ICH zu bieten. Es ist keine Operation erforderlich, um eine Blutung zu initiieren oder zelluläre Prozesse über längere Zeit nach einer Verletzung zu überwachen. Die hohe Fruchtbarkeit von Zebrafisch-Paarungen erzeugt leicht zugängliche und große Probengrößen, und durch die schnelle Entwicklung der Larven wird die experimentelle Zeitachse im Vergleich zu den Nagetierstudien29,30 deutlich reduziert.
Derzeit sind diese Modelle geeignet, um die unmittelbare pathologische und immunologische Reaktion auf spontane ICH im Gehirn von lebenden intakten Tieren zu erklären. Möglicherweise kann dieses Modell für mittelhohe Durchsatzmedikamente für ICH-Therapien angepasst werden, egal ob präventiv oder recovery gefördert werden. Die in dieser Studie vorgestellten Post-ICH-Pathologien stellen daher eine alternative, sich ergänzende Plattform für die präklinische ICH-Forschung dar.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. David Spiller und der University of Manchester Systems Microscopy Core Facility für den Einsatz der Geräte, Prof. Richard Baines für den Einsatz von DanioVision und Dr. Jack Rivers-Auty für die statistische Beratung. Die BBh-Linie wurde freundlicherweise von Nicole Munsie vom Labor von Dr. Sarah Child an der Universität Calgary geteilt. Wir danken auch Prof. Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock und Dr. Helen Young für die Fischlinien und-ausrüstung.
Diese Studie wurde unterstützt von der NC3Rs (NC/N002598/1), der Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) und der British Heart Foundation (FS/15/32038). Besonders dankbar sind wir auch dem Natalie Kate Moss Trust und der Fakultät für Biologie, Medizin und Gesundheit der Universität Manchester für ihre weitere finanzielle Unterstützung.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |