Her præsenterer vi en protokol til kvantificering af hjerneskade, underskud i bevægeapparatet og neuroinflammation efter blødning i hjernen i zebrafisklarver, i forbindelse med humant intracerebralt blødning (ICH).
Trods den mest alvorlige under type af slagtilfælde med høj global dødelighed, er der ingen specifik behandling for patienter med intracerebralt blødning (ICH). Modellering ICH præ-klinisk har vist sig vanskeligt, og nuværende gnaver modeller dårligt rekapitulere den spontane karakter af menneskelige ICH. Der er derfor et presserende behov for alternative prækliniske metoder til undersøgelse af sygdomsmekanismer i ICH og for potentiel lægemiddel opdagelse.
Brugen af zebrafisk er en stadig mere populær tilgang til Translationel forskning, primært på grund af en række fordele, som de besidder over pattedyr modeller af sygdom, herunder produktive reproduktions rater og larve gennemsigtighed, der giver mulighed for levende Imaging. Andre grupper har fastslået, at zebrafisklarver kan udvise spontan ICH efter genetisk eller kemisk afbrydelse af cerebrovaskulær udvikling. Formålet med denne metode er at udnytte sådanne modeller til at studere de patologiske konsekvenser af hjerneblødning, i forbindelse med præklinisk ICH forskning. Ved hjælp af levende billeddannelse og motilitet assays, hjerneskade, neuroinflammation og lokomotor funktion efter ICH kan vurderes og kvantificeres.
Denne undersøgelse viser, at de vigtigste patologiske konsekvenser af hjerneblødning hos mennesker bevares i zebrafisklarver, der fremhæver model organismen som et værdifuldt in vivo-system til præklinisk undersøgelse af ICH. Formålet med denne metode er at gøre det muligt for det prækliniske slag samfund at anvende zebrafisklarve modellen som et alternativt modelsystem til gnavere.
Intracerebral blødning (ICH) er den mest alvorlige sub-type af slagtilfælde forbundet med spontan cerebral kar ruptur og blødning i parenkym fører til hjerneskade, fysisk handicap og ofte død1. På trods af den høje dødelighed og sygelighed, der er forbundet med ICH2, mangler der stadig forståelse for den understøttende ætiologi og patologi efter hæmoragi. Som sådan, der er ingen specifikke behandlinger for at forhindre ICH eller forbedre patientens resultater. De fleste af vores forståelse af sygdom biologi er kommet fra prækliniske gnaver modeller af ICH3, men undersøgelser til dato i disse modeller har undladt at oversætte nogen vellykket terapeutisk til klinikken4,5. Denne fiasko kan skyldes delvis, at nogle begrænsninger af disse prækliniske modeller, herunder manglende evne til nemt at rekapitulere den spontane karakter af menneskelig sygdom og kravet om invasiv kirurgi til at generere modellerne i pattedyr6. Derudover, gnavere udgør praktiske problemer med hensyn til at observere den hurtige indtræden af cellulære reaktioner på ICH i intakt væv. I betragtning af manglen på oversættelse fra gnaver modeller er det bydende nødvendigt at udvikle alternative modeller af spontan ICH, hvis vi skal overvinde disse praktiske problemer og hjælpe med at identificere nye narkotika målsætninger.
De molekylære mekanismer for vaskulær udvikling er velbevaret blandt hvirveldyr, herunder zebrafisk (Danio rerio)7. Som sådan, vedtagelsen af denne model organisme er ved at blive en stadig mere nyttig mekanistisk strategi for at studere cerebrovaskulær sygdom8. Der er genereret en række zebrafiske modeller, som rekapitulere fænotyper forbundet med slagtilfælde-relaterede betingelser9,10,11,12. Brugen af zebrafiske larver til at undersøge sygdoms patogenesen giver både praktiske og videnskabelige fordele i forhold til pattedyrs modeller8. Dette omfatter høje reproduktions rater, hurtig udvikling og larve gennemsigtighed, der giver mulighed for intravital billeddannelse uden de invasive begrænsninger forbundet med gnavere. Kobling af disse fordele med den brede vifte af transgene reporter linjer til rådighed inden for: zebrafisk forskning samfund udgør en kraftfuld in vivo tilgang til at studere sygdoms biologi, endnu ikke udnyttet til at studere den patologiske konsekvenser af ICH.
Skaden respons på blod i hjernen er bifasisk13; den primære fornærmelse forårsager neuronal død og celle nekrose, som derefter indleder en sekundær bølge af skader, der er induceret af medfødte immun aktivering. Den anden fase af hjerneskade, især den Neuro inflammatoriske komponent, betragtes som et realistisk mål for fremtidig narkotikabehandling13. Spontane og cerebral-specifikke blødninger er blevet beskrevet i: zebrafisk larver tidligere14,15,16,17,18,19. To sådanne modeller er brugen af atorvastatin (ATV) ved 24 h post-befrugtning (HPF) at hæmme HMGCR pathway og kolesterol biosyntese14, og en bubblehead (BBH) mutant, som udtrykker en hypomorphic mutation i arhgef7 genet, βpix, hæmmer efterfølgende aktiv remodellering for stramme endovaskulære vejkryds18. Disse modeller udviser spontan cerebral-specifikke blodkar ruptur i begyndelsen af cirkulation (~ 33 HPF). For nylig har vi karakteriseret disse modeller yderligere at afsløre, at centrale aspekter af hjernen skaden respons er bevaret mellem mennesker og: zebrafisk larver20. Denne undersøgelse viser den metodologi, der kræves for at opnå og visualisere spontane hjerneblødninger i: zebrafisk larver, og hvordan man kan kvantificere hjerneskade, og lokomotor og Neuro inflammatoriske fænotyper, der relaterer til den menneskelige tilstand. Disse data og teknikker understøtter brugen af denne model art som et værdifuldt supplerende system til præklinisk ICH-forskning.
Denne undersøgelse viser, at ICH i: zebrafisk larver inducerer en hjerneskade respons, der genberegner centrale aspekter af den menneskelige tilstand, der kan systematisk analyseres og kvantificeres. Zebrafish tilbyder en konsistent og reproducerbar model af spontan ICH, som vil hjælpe med fremtidige Drug intervention undersøgelser fokuseret på at målrette blod-induceret hjerneskade, snarere end at forhindre fartøjet ruptur17,28. I betragtning af den hurtige karakter af sygdommens opståen beslægtet med den kliniske situation, en sådan tilgang giver spændende udsigter til vellykket oversættelse i fremtiden.
Nogle begrænsninger er forbundet med brugen af: zebrafisk larver, såsom brugen af et udviklingssystem og taksonomisk rang, men de praktiske og videnskabelige fordele ved denne model skal anses for at give ny indsigt i ICH. Der kræves ingen operation for at initiere en blødning eller for at overvåge cellulære processer over længere perioder efter skaden. Høj frugtbarhed af: zebrafisk bindinger generere let tilgængelige og store stikprøvestørrelser, og på grund af den hurtige udvikling af larverne den eksperimentelle tidslinje er væsentligt reduceret i forhold til gnaver undersøgelser29,30.
I øjeblikket disse modeller er egnet til brug for belysning af den umiddelbare patologiske og immunologiske reaktion på spontan ICH i hjernen af levende intakte dyr. Potentielt kan denne model tilpasses til medium-høj gennemløb stof skærme til ICH behandlinger, uanset om forebyggende eller nyttiggørelse fremme. Som sådan udgør de post-ICH-sygdomme, der præsenteres i denne undersøgelse, en alternativ, komplementær platform for præklinisk ICH-forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. David spiller og University of Manchester Systems Microscopy Core facilitet for brug af udstyret, Prof. Richard Baines for brugen af DanioVision og Dr. Jack Rivers-auty til statistisk konsultation. BBH linjen blev venligt delt af Nicole Munsie fra Dr. Sarah Child ‘s Lab på University of Calgary. Vi takker også Prof. Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock og Dr. Helen Young for fiske linjer og udstyr.
Dette studie blev støttet af NC3Rs (NC/N002598/1), slagtilfælde Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) og British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Vi er også særligt taknemmelige for Natalie Kate Moss Trust og University of Manchester fakultetet for biologi, medicin og sundhed for deres fortsatte økonomiske støtte.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |