Nous présentons ici un protocole pour quantifier les lésions cérébrales, les déficits locomoteurs et la neuroinflammation suite à des saignements dans le cerveau chez les larves de zébrafish, dans le contexte de l’hémorragie intracérébrale humaine (ICH).
En dépit d’être le sous-type le plus sévère de l’AVC avec une mortalité mondiale élevée, il n’y a pas de traitement spécifique pour les patients atteints d’hémorragie intracérébrale (ICH). La modélisation du PCI pré-clinique a prouvé qu’il était difficile, et les modèles actuels de rongeurs ont peu récapitulé la nature spontanée du PCI humain. Par conséquent, il existe une exigence urgente pour les méthodologies précliniques alternatives pour l’étude des mécanismes de la maladie dans le PCI et pour la découverte potentielle de médicaments.
L’utilisation du zébrafish représente une approche de plus en plus populaire pour la recherche translationnelle, principalement en raison d’un certain nombre d’avantages qu’ils possèdent sur les modèles de maladie de mammifères, y compris les taux de reproduction prolifique et la transparence larvaire permettant de vivre Imagerie. D’autres groupes ont établi que les larves de zébrafish peuvent présenter une ICH spontanée suite à une perturbation génétique ou chimique du développement cérébro-vasculaire. L’objectif de cette méthodologie est d’utiliser de tels modèles pour étudier les conséquences pathologiques de l’hémorragie cérébrale, dans le contexte de la recherche préclinique du PCI. En utilisant des tests d’imagerie et de motilité en direct, les lésions cérébrales, la neuroinflammation et la fonction locomotrice suivant le PCI peuvent être évaluées et quantifiées.
Cette étude montre que les principales conséquences pathologiques de l’hémorragie cérébrale chez l’homme sont conservées dans les larves de zébrafish soulignant l’organisme modèle comme un précieux système in vivo pour l’investigation préclinique du PCI. L’objectif de cette méthodologie est de permettre à la communauté des AVC précliniques d’employer le modèle larvaire du zébrafish comme système de modèle complémentaire alternatif aux rongeurs.
L’hémorragie intracérébrale (ICH) est le sous-type le plus sévère de l’AVC associé à la rupture spontanée des vaisseaux cérébraux et aux saignements dans le parenchyme entraînant des lésions cérébrales, une déficience physique et souvent la mort1. Malgré le taux élevé de mortalité et de morbidité associé à l’ICH2, la compréhension de l’étiologie sous-jacente et de la pathologie post-hémorragique fait encore défaut. En tant que tel, il n’y a pas de traitements spécifiques pour prévenir le PCI ou améliorer les résultats des patients. La plupart de notre compréhension de la biologie de la maladie est venu de modèles de rongeurs pré-cliniques de ich3, cependant les études à ce jour dans ces modèles n’ont pas réussi à traduire n’importe quel thérapeutique réussie à la clinique4,5. Cet échec peut être dû en partie à certaines limitations de ces modèles précliniques, y compris l’incapacité de récapituler facilement la nature spontanée de la maladie humaine et l’exigence d’une chirurgie invasive pour générer les modèles chez les mammifères6. En outre, les rongeurs posent des problèmes pratiques en ce qui concerne l’observation de l’apparition rapide des réponses cellulaires au PCI dans les tissus intacts. Étant donné le manque de traduction des modèles de rongeurs, le développement de modèles alternatifs de PCI spontané est impératif si nous voulons surmonter ces problèmes pratiques et aider à identifier de nouveaux objectifs de drogue.
Les mécanismes moléculaires du développement vasculaire sont bien conservés parmi les vertébrés, y compris le zébrafish (Danio rerio)7. En tant que tel, l’adoption de cet organisme modèle devient une stratégie mécaniste de plus en plus utile pour l’étude de la maladie cérébro-vasculaire8. Un certain nombre de modèles de zébrafish ont été générés qui récapitulent les phénotypes associés aux affections liées aux AVC9,10,11,12. L’utilisation de larves de zébrafish pour enquêter sur la pathogenèse des maladies offre des avantages pratiques et scientifiques sur les modèles de mammifères8. Cela inclut des taux de reproduction élevés, un développement rapide et une transparence larvaire qui permet l’imagerie intravitale sans les contraintes invasives associées aux rongeurs. Le couplage de ces avantages avec le large éventail de lignes transgéniques de reporter disponibles dans la communauté de recherche poisson zèbre équivaut à une puissante approche in vivo pour l’étude de la biologie des maladies, non encore utilisée pour l’étude de la pathologie conséquences du PCI.
La réponse de blessure au sang dans le cerveau est biphasique13; l’insulte primaire provoque la mort neuronale et la nécrose cellulaire, qui déclenche alors une vague secondaire de dommages qui est induite par l’activation immunitaire innée. La deuxième phase de lésion cérébrale, en particulier la composante neuroinflammatoire, est considérée comme une cible réaliste pour le traitement futur des médicaments13. Des hémorragies spontanées et cérébrales spécifiques ont été décrites dans les larves de zébrafish précédemment14,15,16,17,18,19. Deux de ces modèles sont l’utilisation de l’atorvastatine (ATV) à 24 h après la fécondation (HPF) pour inhiber la voie du HMGCR et la biosynthèse du cholestérol14, et un mutant de la tête de andouille (BBH) qui expriment une mutation hypomorphe dans le gène arhgef7 , βpix, et inhibe ensuite le remodelage de l’actine pour les jonctions endovasculaires serrées18. Ces modèles présentent une rupture spontanée du vaisseau sanguin spécifique au cerveau au début de la circulation (~ 33 HPF). Récemment, nous avons caractérisé ces modèles plus loin pour révéler que les aspects clés de la réponse aux lésions cérébrales sont conservés entre les humains et les larves de zébrafish20. Cette étude démontre la méthodologie nécessaire pour obtenir et visualiser les hémorragies cérébrales spontanées chez les larves de zébrafish et comment quantifier les lésions cérébrales, et les phénotypes locomoteurs et neuroinflammatoires qui se rapportent à la condition humaine. Ces données et techniques appuient l’utilisation de cette espèce modèle comme un système complémentaire précieux pour la recherche préclinique du PCI.
Cette étude montre que le PCI dans les larves de zébrafish induit une réponse aux lésions cérébrales qui récapitule les aspects clés de la condition humaine qui peuvent être systématiquement analysés et quantifiés. Le zébrafish offre un modèle cohérent et reproductible de l’ICH spontané qui aidera les études futures d’intervention médicamenteuse axées sur le ciblage des lésions cérébrales induites par le sang, plutôt que d’empêcher la rupture des vaisseaux17,28. En effet, étant donné le caractère rapide de l’apparition de la maladie qui s’apparente à la situation clinique, une telle approche offre des perspectives intéressantes pour une traduction réussie à l’avenir.
Certaines limitations sont associées à l’utilisation de larves de zébrafish, comme l’utilisation d’un système en développement et le classement taxonomique, mais les avantages pratiques et scientifiques de ce modèle doivent être considérés comme offrant de nouvelles perspectives sur le PCI. Aucune intervention chirurgicale n’est nécessaire pour déclencher une hémorragie ou pour surveiller les processus cellulaires pendant de longues périodes de temps après une blessure. La fécondité élevée des appariements de zébrafish génère des tailles d’échantillon facilement accessibles et de grande taille, et en raison du développement rapide des larves, la chronologie expérimentale est significativement réduite par rapport aux études de rongeurs29,30.
Actuellement, ces modèles sont aptes à être utilisés pour élucider la réponse pathologique et immunologique immédiate au PCI spontané dans le cerveau des animaux vivants intacts. Potentiellement, ce modèle peut être adapté pour les écrans de médicaments à moyen-haut débit pour les thérapies ICH, qu’ils soient préventifs ou valorisant la valorisation. Ainsi, les pathologies post-ICH présentées dans cette étude représentent une plate-forme alternative et complémentaire pour la recherche préclinique du PCI.
The authors have nothing to disclose.
Nous aimerions remercier le Dr David Spiller et l’Université de Manchester Systems microscopie Core Facility pour l’utilisation de l’équipement, le Prof. Richard Baines pour l’utilisation de DanioVision et Dr. Jack Rivers-Auty pour la consultation statistique. La ligne BBH a été aimablement partagée par Nicole Munsie du laboratoire du Dr. Sarah Child à l’Université de Calgary. Nous remercions également le Prof. Stephen Renshaw, le Dr Adam Hurlstone, le Dr Andrew Badrock et le Dr Helen Young pour les lignes et l’équipement de poisson.
Cette étude a été appuyée par la NC3Rs (NC/N002598/1), Association AVC (TSA LECTI2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) et la British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Nous sommes également particulièrement reconnaissants à la Natalie Kate Moss Trust et à la faculté de biologie, médecine et santé de l’Université de Manchester pour leur soutien financier continu.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |