Burada insan intrakerebral kanama (Ich) bağlamında, zebra balığı larvalarda beyinde kanama sonrasında beyin yaralanması, lokomotor açıkları ve nöroinflamasyonu ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Yüksek küresel mortalite ile en şiddetli inme alt türüne rağmen, intrakerebral kanama (ıCH) olan hastalarda spesifik bir tedavi yoktur. Modelleme Ich önceden klinik olarak zor kanıtlanmıştır, ve mevcut kemirgen modelleri kötü insan Ich spontan doğası özetlemek. Bu nedenle, ıCH ‘de hastalık mekanizmalarının incelenmesi ve potansiyel uyuşturucu keşfi için alternatif klinik öncesi metodolojiler için acil bir gereksinim vardır.
Zebra balığı kullanımı translasyonel araştırma için giderek daha popüler bir yaklaşım temsil eder, öncelikle yararları bir dizi nedeniyle hastalığın memeli modelleri üzerinde sahip, üretken üreme oranları ve larva şeffaflık canlı için izin dahil olmak üzere Görüntüleme. Diğer gruplar, zebra balığı larvaları serebrovasküler gelişmenin genetik veya kimyasal bozulması sonrasında spontan Ich ‘yi sergileyebilir. Bu metodolojinin amacı, klinik öncesi ıCH araştırmaları bağlamında beyin kanama patolojik sonuçlarını incelemek için bu tür modelleri kullanmaktır. Canlı görüntüleme ve motilite yöntemleri kullanarak, ıCH aşağıdaki beyin hasarı, nöroinflamasyon ve Lokomotor işlevi değerlendirilebilir ve nicelik.
Bu çalışmada, insanlarda beyin kanamanın önemli patolojik sonuçlarının zebra balığı larvalar içinde, model organizmayı Ich ‘nin klinik öncesi incelenmesi için değerli bir in vivo sistemi olarak vurgulayarak tutulmasını göstermektedir. Bu metodolojinin amacı, klinik öncesi inme topluluğunun zebra balığı larva modelini kemirgenler için alternatif bir tamamlayıcı model sistemi olarak kullanmalarını sağlamak.
İntrakerebral kanama (ıCH), spontan serebral damar rüptür ve beyin hasarı, fiziksel özürlülük ve genellikle ölüm1olan parankimat içine kanama ile ilişkili en şiddetli alt tip inme olduğunu. Ich2ile ilişkili yüksek mortalite ve morbidite oranına rağmen, destek etiyolojisi ve kanama sonrası patolojinin anlaşılması hala eksiktir. Bu nedenle, ıCH önlemek veya hasta sonuçlarını iyileştirmek için özel tedaviler yoktur. Hastalık biyolojisinin anlayışımızın çoğu, Ich3‘ ün klinik öncesi kemirgen modellerinden geliyor, ancak bu modellerde yapılan çalışmalar, herhangi bir başarılı terapötik terapi için klinik4,5‘ e çeviremedi. Bu başarısızlık kısmen, bu preklinik modellerin bazı sınırlamalar için, kolayca insan hastalığının spontan doğası ve invaziv cerrahi gereksinimi memelilerde modelleri oluşturmak için reapitulate dahil olmak üzere olabilir6. Ayrıca, kemirgenler bozulmamış doku içinde ıCH hücresel tepkiler hızlı başlangıcı gözlemlemeye ilişkin pratik sorunlar oluşturmaktadır. Kemirgen modellerinden çeviri eksikliği göz önüne alındığında, spontan ıCH alternatif modelleri geliştirmek bu pratik sorunları aşmak ve yeni uyuşturucu hedeflerini belirlemeye yardımcı olmak için zorunludur.
Vasküler gelişimin moleküler mekanizmaları, zebra balığı (Danio rerio)7de dahil olmak üzere vertebratlar arasında iyi şekilde tutulurlar. Bu nedenle, bu model organizmanın benimsenmesi serebrovasküler hastalığı incelemek için her zamankinden daha kullanışlı bir mekanik strateji haline geliyor8. Bir dizi zebra balığı modelleri, inme ile ilgili koşullar ile ilgili fenotipleri özetlemek üretilir9,10,11,12. Hastalık patogenezi araştırmak için zebra balığı larvaları kullanımı, memelinin modelleri üzerinde hem pratik hem de bilimsel avantajlar sunar8. Bu yüksek üreme oranları, hızlı gelişim ve intravital görüntüleme için kemirgenler ile ilişkili invaziv kısıtlamalar olmadan sağlar larva şeffaflık içerir. Zebra balığı araştırma topluluğunun içinde mevcut olan çok çeşitli transgenik muhabir hatları ile bu avantajları kavramak, hastalık biyolojisi eğitimi için güçlü bir In vivo yaklaşımıdır, henüz patolojik çalışmalar için kullanılmaz ıCH sonuçları.
Beynin kan yaralanma tepkisi bifazik13; birincil hakaret nöronal ölüm ve hücre nekrozu neden olur, daha sonra doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu ile indüklenen bir hasar ikincil dalgası başlatır. Beyin yaralanması ikinci aşaması, özellikle nöroinflamatuar bileşeni, gelecekteki ilaç tedavisi için gerçekçi bir hedef olarak kabul edilir13. Zebra balığı larvaları daha önce14,15,16,17,18,19‘ da spontan ve serebral özel hemorajler tarif edilmiştir. İki tür modeller atorvastatin kullanımı (ATV) at 24 h sonrası fertilizasyon (HPF) inhibe hmgcr yol ve kolesterol biyosentezi14, ve bir balon kafa (BBH) arhgef7 geni bir Hipomorfik mutasyon ifade mutant, βpix, ve daha sonra sıkı endovasküler kavşaklar için aktin remodeling inhibe18. Bu modeller dolaşım başlangıcında spontan serebral spesifik kan damar rüptürü sergiler (~ 33 HPF). Son zamanlarda, bu modeller daha fazla beyin hasarı tepkisi önemli yönlerini insanlar ve zebra balığı larvaları arasında tutulmaktadır ortaya çıkarmak için karakterize ettik20. Bu çalışmada, zebra balığı larvaları içinde spontan beyin hemorajinin elde edilmesi ve görselleştirilmesi için gereken metodoloji ve insan durumu ile ilgili olarak beyin yaralanması, lokomotor ve nöroinflamatuar fenotiplerin nasıl ölçüleceği gösterilmektedir. Bu veri ve teknikler, klinik öncesi ıCH araştırmaları için değerli bir tamamlayıcı sistem olarak bu model türlerinin kullanımını desteklemektedir.
Bu çalışmada, zebra balığı larvaları içinde Ich sistematik olarak tespit edilebilir ve niceliksel olabilir insan durumunun önemli yönlerini yeniden bir beyin hasarı tepkisi indükleyen gösterir. Zebrafish, damar rüptürü17,28‘ i önlemek yerine kan kaynaklı beyin yaralanmasını hedeflemeye odaklanan gelecekteki ilaç müdahalesi çalışmalarına yardımcı olacak spontan Ich ‘nin tutarlı ve tekrarlanabilir bir modelini sunar. Nitekim, hastalığın başlangıcı klinik duruma benzeyen hızlı doğası göz önüne alındığında, böyle bir yaklaşım gelecekte başarılı çeviri için heyecan verici umutları sunuyor.
Bazı sınırlamalar zebra balığı larva kullanımı ile ilişkilidir, örneğin gelişmekte olan bir sistemin kullanımı ve taksononomik rütbe, ancak bu modelin pratik ve bilimsel avantajları Ich yeni Öngörüler sunmak için dikkate alınmalıdır. Yaralanmadan sonra uzun süre boyunca bir kanama veya hücresel süreçleri izlemek için hiçbir ameliyat gerektirmez. Zebra balığı eşleştirmeleri yüksek büyüklükleri kolayca erişilebilir ve büyük Numune boyutları oluşturmak ve larvalar hızlı gelişimi nedeniyle deneysel zaman çizelgesi kemirgen çalışmaları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır29,30.
Şu anda bu modeller canlı bozulmamış hayvanların beyinde spontan Ich hemen patolojik ve immünolojik yanıt aydınlatılmasına için kullanılmak üzere uygundur. Potansiyel olarak, bu model ıCH terapileri için orta-yüksek verimlilik ilaç ekranları için adapte edilebilir, ister önleyici veya kurtarma teşvik. Bu nedenle, bu çalışmada sunulan Post-ıCH patolojileri, klinik öncesi ıCH araştırmaları için alternatif ve tamamlayıcı bir platform oluşturmaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Biz Dr David Spiller ve Manchester Systems mikroskopisi çekirdek tesis Üniversitesi ekipman kullanımı için teşekkür etmek istiyorum, Prof Richard Baines için DanioVision ve Dr Jack Rivers kullanımı için-Auty istatistiksel Danışma için. BBH hattı, Nicole Munsie tarafından Calgary Üniversitesi ‘nde Dr. Sarah Child ‘ın laboratuarından paylaşıldı. Ayrıca balık hatları ve ekipmanları için Prof. Stephen Renshaw, Dr. adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock ve Dr. Helen Young ‘a da teşekkür ederiz.
Bu çalışmada NC3Rs (NC/N002598/1), Inme Derneği (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (Bay/M501803/1) ve Ingiliz Kalp Vakfı (FS/15/67/32038) tarafından destekleniyordu. Biz de özellikle Natalie Kate Moss Trust ve Manchester Üniversitesi Biyoloji Fakültesi, tıp ve sağlık için onların sürekli mali destek için minnettarız.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |