Qui vi presentiamo un protocollo per quantificare la lesione cerebrale, deficit riabilitazione Locomotor e neuroinfiammazione dopo sanguinamento nel cervello nelle larve di pesce zebra, nel contesto dell’emorragia intracerebrale umana (Ich).
Nonostante sia il sottotipo più grave di ictus con elevata mortalità globale, non esiste un trattamento specifico per i pazienti con emorragia intracerebrale (ICH). Modellazione ICH pre-clinicamente ha dimostrato difficile, e modelli di roditori attuali scarsamente ricapitolare la natura spontanea del ICH umano. Pertanto, vi è un requisito urgente per le metodologie precliniche alternative per lo studio dei meccanismi di malattia in ICH e per la potenziale scoperta di farmaci.
L’uso di pesce zebra rappresenta un approccio sempre più diffuso per la ricerca traslazionale, principalmente a causa di una serie di vantaggi che possiedono sui modelli di malattia dei mammiferi, compresi i tassi di riproduzione prolifico e la trasparenza larvale che consente di vivere Imaging. Altri gruppi hanno stabilito che le larve di pesce zebra possono esibire un ICH spontaneo a seguito di rottura genetica o chimica dello sviluppo cerebrovascolare. L’obiettivo di questa metodologia è quello di utilizzare tali modelli per studiare le conseguenze patologiche dell’emorragia cerebrale, nel contesto della ricerca pre-clinica di ICH. Utilizzando analisi Live di imaging e motilità, danno cerebrale, neuroinfiammazione e funzione locomotore dopo ICH possono essere valutati e quantificati.
Questo studio mostra che le principali conseguenze patologiche dell’emorragia cerebrale negli esseri umani sono conservate nelle larve di zebra che evidenziano l’organismo modello come un prezioso sistema in vivo per le indagini pre-cliniche di ICH. L’obiettivo di questa metodologia è quello di consentire alla comunità di ictus preclinico di impiegare il modello larvale del pesce zebra come sistema alternativo complementare ai roditori.
Emorragia intracerebrale (ICH) è il Sub-tipo più grave di ictus associato con la rottura del vaso cerebrale spontaneo e sanguinamento nel parenchima che conduce a danni cerebrali, disabilità fisica e spesso la morte1. Nonostante l’alto tasso di mortalità e morbilità associato a ICH2, manca ancora la comprensione dell’eziologia alla base e della patologia post-emorragia. Come tale, non ci sono trattamenti specifici per prevenire ICH o migliorare i risultati dei pazienti. La maggior parte della nostra comprensione della biologia delle malattie è venuto da modelli di roditori pre-clinici di ich3, tuttavia gli studi finora in questi modelli non sono riusciti a tradurre qualsiasi terapeutico di successo per la clinica4,5. Questo fallimento può essere dovuto in parte, ad alcune limitazioni di questi modelli preclinici, tra cui l’incapacità di ricapitolare facilmente la natura spontanea della malattia umana e il requisito di chirurgia invasiva per generare i modelli nei mammiferi6. Inoltre, i roditori pongono problemi pratici per quanto riguarda l’osservazione della rapida insorgenza delle risposte cellulari all’ICH nel tessuto intatto. Data la mancanza di traduzione da modelli di roditori, lo sviluppo di modelli alternativi di ICH spontanea è imperativo se vogliamo superare questi problemi pratici e contribuire a identificare nuovi bersagli di droga.
I meccanismi molecolari dello sviluppo vascolare sono ben conservati tra i vertebrati tra cui il pesce zebra (Danio rerio)7. Come tale, l’adozione di questo organismo modello sta diventando una strategia meccanicistica sempre più utile per lo studio della malattia cerebrovascolare8. Sono stati generati diversi modelli di pesce zebra che ricapitolano i fenotipi associati alle condizioni relative al tratto9,10,11,12. L’uso di larve di pesce zebra per indagare sulla patogenesi delle malattie offre vantaggi pratici e scientifici rispetto ai modelli di mammiferi8. Questo include elevati tassi di riproduzione, rapido sviluppo e trasparenza larvale che consente l’imaging intravital senza i vincoli invasivi associati ai roditori. L’accoppiamento di questi vantaggi con l’ampia gamma di linee reporter transgeniche disponibili all’interno della comunità di ricerca del pesce zebra equivale a un potente approccio in vivo per lo studio della biologia delle malattie, non ancora utilizzato per lo studio della patologia patologica conseguenze di ICH.
La risposta di lesione al sangue nel cervello è bifasica13; l’insulto primario provoca la morte neuronale e la necrosi cellulare, che poi avvia un’ondata secondaria di danno che è indotta dall’attivazione immunitaria innata. La seconda fase della lesione cerebrale, in particolare la componente neuroinfiammatoria, è considerata un bersaglio realistico per il futuro trattamento farmacologico13. Le emorragie spontanee e specifiche cerebrali sono state descritte nelle larve di pesce zebra precedentemente14,15,16,17,18,19. Due di questi modelli sono l’uso di atorvastatina (ATV) a 24 h post-fecondazione (HPF) per inibire la via HMGCR e biosintesi del colesterolo14, e un mutante di incompetente (BBH) che esprimono una mutazione ipomorfico nel gene arhgef7 , βpix, e successivamente inibisce il rimodellamento dell’actina per giunzioni endovascolare strette18. Questi modelli presentano una rottura del vaso sanguigno cerebrale-specifica spontanea all’inizio della circolazione (~ 33 HPF). Recentemente, abbiamo caratterizzato questi modelli ulteriormente per rivelare che gli aspetti chiave della risposta al danno cerebrale è conservato tra gli esseri umani e larve di pesce zebra20. Questo studio illustra la metodologia necessaria per ottenere e visualizzare le emorragie cerebrali spontanee nelle larve di pesce zebra e come quantificare la lesione cerebrale, e i fenotipi riabilitazione Locomotor e NEUROINFIAMMATORI che si riferiscono alla condizione umana. Questi dati e tecniche sostengono l’uso di questa specie di modello come un prezioso sistema complementare per la ricerca pre-clinica di ICH.
Questo studio mostra che l’ich nelle larve di pesce zebra induce una risposta al trauma cerebrale che riassume gli aspetti chiave della condizione umana che possono essere sistematicamente analizzati e quantificati. Zebrafish offre un modello coerente e riproducibile di ICH spontaneo che aiuterà con futuri studi di intervento farmacologico focalizzati sul bersaglio di lesioni cerebrali indotta dal sangue, piuttosto che prevenire la rottura della nave17,28. Infatti, data la rapida natura dell’insorgenza della malattia simile alla situazione clinica, tale approccio offre interessanti prospettive per la traduzione di successo in futuro.
Alcune limitazioni sono associate all’uso di larve di pesce zebra, come l’uso di un sistema di sviluppo e di rango tassonomico, tuttavia i vantaggi pratici e scientifici di questo modello devono essere considerati per offrire nuove intuizioni in ich. Non è necessario alcun intervento chirurgico per avviare un’emorragia o per monitorare i processi cellulari per lunghi periodi di tempo dopo la lesione. Alta fecondità di abbinamenti pesce zebra generano dimensioni del campione facilmente accessibili e grandi, e a causa del rapido sviluppo delle larve la Timeline sperimentale è significativamente ridotta rispetto agli studi sui roditori29,30.
Attualmente questi modelli sono idonei all’uso per chiarire la risposta patologica e immunologica immediata all’ICH spontaneo nel cervello degli animali vivi intatti. Potenzialmente, questo modello può essere adattato per schermi di droga a medio-alta velocità per le terapie ICH, sia preventivo o recupero promozione. Come tale, le patologie post-ICH presentate in questo studio rappresentano una piattaforma alternativa, complementare per la ricerca pre-clinica di ICH.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare il dottor David Spiller e l’Università di Manchester sistemi microscopia Core Facility per l’uso delle attrezzature, il Prof. Richard Baines per l’uso di DanioVision e Dr. Jack Rivers-Auty per la consultazione statistica. La linea BBH è stata gentilmente condivisa da Nicole Munsie dal laboratorio del dottor Sarah Child presso l’Università di Calgary. Ringraziamo anche il Prof. Stephen Renshaw, il dottor Adam Hurlstone, il dottor Andrew Badrock e il dottor Helen Young per le linee e le attrezzature per il pesce.
Questo studio è stato supportato da NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) e British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Siamo anche particolarmente grati alla Natalie Kate Moss Trust e alla facoltà di biologia, medicina e sanità dell’Università di Manchester per il loro continuo sostegno finanziario.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |