fumarylacetotatetate하이드라세아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현 및 정제는 예시(대장균, FPLC에서발현)로 기재된다. 정제된 단백질은 결정화 및 항체 생산에 사용되며 효소 공아에 사용됩니다. 선택된 광측정 분석제는 옥살로아세테이트 데카르박실라제 및 아실피루베테 하이드로라제로서 FAHD1의 다기능성을 표시하기 위해 제시된다.
Fumarylacetotate 하이드라제 (FAH) 도메인 함유 단백질 (FAHD)는 진핵생물에 있는 FAH 수퍼패밀리의 확인된 일원입니다. 이 수퍼 패밀리의 효소는 일반적으로 주로 하이드로라제및 데카르복실라아제 메커니즘을 포함하는 다기능성을 나타낸다. 본 문서에서는 FAHD 단백질의 발현 및 정제를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 주로 FAHD 단백질 1(FAHD1) 종(인간, 마우스, 선충류, 식물 등)을 소개한다. 커버된 방법은 대장균,친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예비 및 분석 젤 여과, 결정화, X선 회절 및 광측정 분석에서의 단백질 발현입니다. 높은 수준의 순도의 농축 단백질 (>98%) 결정화 또는 항체 생산에 사용될 수 있다. 유사하거나 낮은 품질의 단백질은 효소 검정에 사용되거나 검출 시스템에서 항원으로 사용될 수 있다(Western-Blot, ELISA). 이 작품에 대한 토론에서 FAHD1의 식별된 효소 메커니즘은 하이드라제 및 데카르박실라아제 이중 기능을 보다 자세하게 설명하기 위해 설명되어 있습니다.
fumarylacetotatetate하이드라아제 (FAH)1,2 효소의 수퍼 패밀리는 고도로 보존된 촉매 FAH 도메인3,4,5,6을 공유하는 효소의 그룹을 기술합니다. , 7명 , 8개 , 9개 , 10. 일반적인 촉매 센터에도 불구하고, 이 효소는 다기능이며, 대부분은 원핵생물에서 발견되며, 여기서 그들은 복잡한 탄소 원에서 회수된 화합물을 분해하는 데 사용된다3. 이 가족의 단지 3명의 일원은 지금까지 진핵생물에서 확인되었습니다: FAH2를주는 이름, 뿐 아니라 FAH 도메인 포함 단백질 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 및 FAH 도메인 함유 단백질 2 (FAHD2). FAHD1의 고갈은 손상된 미토콘드리아 호흡과 연관되었습니다13,16 및 중간 잠재력에 연결되는 세포 노화 표현형14의 가역적인 모형과 연관되었습니다 전자 수송 시스템의 단점. 인간 FAHD1 및 모델 시스템 (마우스, 선충, 암 세포주, 식물 등)에서의 정형 고리 뿐만 아니라 선택된 점 돌연변이 변이체는 잠재적인 관심의 약성 표적이 되었습니다. 이 연구를 위해, 순도의 높은 수준에서 재조합 단백질, 결정 구조 및 선택적 항체에 의해 유도 촉매 메커니즘에 대한 정보뿐만 아니라 중요합니다.
이 원고는 대장균,친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 황산 암모늄 침전, 준비 및 분석 젤 여과, 결정화, X선 회절, 및 포토메트릭 분석. 여기에 설명된 방법 및 프로토콜의 목적은 세균학, 식물 생물학, 동물 및 인간 연구와 같은 다양한 분야에서 일하는 과학자들에게 FAH 수퍼패밀리의 구성원을 특성화하는 지침을 제공하는 것입니다. 특성이 없는 수퍼패밀리 구성원이 특정 분야에서 관련성이 있어야 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다른 원핵생물 또는 진핵 FAH 수퍼패밀리 구성원을 특성화하는 것을 목표로 하는 프로젝트에 대한 귀중한 지원을 제공할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법의 뒤에 근거는 잘못 기술된 단백질의 특성화 (특히, 알려지지 않은 생리적 관련성의 신진 대사 효소)를 위해, 정제된 재조합 단백질로 시작하는 접근이 허용한다는 사실입니다 체외 활성 효소 제제, 고품질 항체 및 선택된 효소에 대한 강력하고 특정 한 약리학 적 억제제와 같은 귀중한 고품질 연구 도구개발. 기재된 방법은 빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 X선 결정학을 필요로 합니다. 대체 방법(예를 들어, 화학적 유도 없이 단백질을 발현하거나, 열처리 후 원심분리에 의한 단백질 정제를 표시하기 위해 탈염 및 크기 배제 크로마토그래피를 표시하기 위해),다른곳에서 17에서 발견될 수 있다. FAH 슈퍼 패밀리 효소 2, 7,9,17,18의발현 및 정제를 위해 광범위한 방법을 사용할 수 있지만, 이 작업은 발현에 초점을 맞추고 특히 FAHD 단백질의 정제.
본 원고의 토론 섹션에서, FAHD1 단백질(하이드로라제, 데카르복실라제)에 대해 확인된 촉매 메커니즘(15)은 촉매 반응의 화학적 특성을 입증하기 위해 보다 상세하게 설명한다. 전작7,15,18(PDB: 6FOG, PDB:6FOH)을 기반으로 얻은 데이터는 케토-에놀 이소머라아제로서 효소의 제3 활성을 암시한다.
중요한 단계
FAHD 단백질은 염분 농도에 매우 민감합니다. 낮은 NaCl 농도에서, 단백질은 해동 시 침전 수 있습니다., 하지만 그들은 일반적으로 완전히 높은 소금 농도에서 재구성 될 수 있습니다. 즉, FAHD 단백질이 어떤 이유로 침전되는 경우, 더 높은 염 농도(>300 μM)로 회수또는 재접을 할 수 있다. 그러나 좀 더 소수성 단백질은 회복되지 않을 수 있지만(예: 인간 FAHD2), CHAPS(최대 1%)와 같은 세제 또는 글리세롤 (10%) 안정된 용액을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 어쨌든 액체 질소를 사용하여 충격 동결을 하고 -80 °C에서 보관하는 것이 부드럽고 느린 해동 과정이므로 권장됩니다.
3.1.10 단계에서 Ni-NTA 정제 중에 몇 가지 예기치 않은 문제가 발생할 수 있습니다. 참고로, 제2 수집시료에서 더 높은 OD는 아가로즈 수지의 부피가 너무 높다는 것을 나타낸다(다음 실험에서 적은 수지를 사용한다). 또한, 아가로즈 수지 자체는 280 nm에서 OD 신호로 이어집니다 (즉, 아가로스 수지 베드의 붕괴는 인공 신호를 줄 것이다). 의심의 경우, 단백질 농도 를 결정 하기 위해 브래드포드 또는 BSA 분석 같은 다른 방법을 사용 하는 것이 좋습니다.
효소 성 검안에는 고려해야 할 세 가지 중요한 측면이 있습니다. 첫째, 단백질 농도를 평가하는 것은 정확한 특정 활동을 얻기 위하여 중요합니다. 단백질의 순도 수준은 결과에 영향을 미치고 추정될 필요가 있습니다. 태그가 지정된 단백질의 경우 태그 부분의 질량을 계산해야 하며 특정 활성을 그에 따라 수정해야 합니다. 프로토콜의 섹션 7에 기재된 간단한 분석의 경우, Ni-NTA 순도는 활성 기질과 비활성 기질, 보조 인자 등을 구별하기에 충분하다. 더 복잡한 Michaelis-Menten 역학의 경우 모든 반응물 및 기질 농도를 올바르게 결정해야 합니다. 특히 옥살로아세테이트(시간이 지남에 따라 자동 카르박스실레이트)를 사용할 때 반응의 효소 부분은 자동 탈카르박실화를 위해 수정되어야 합니다(두 반응이 동시에 발생한다는 가정 하에). 기판의 케토 에놀 토토머화로 처리된 광학 밀도 신호의 초기 변화를 고려해야 합니다. 셋째, 농도와 부피를 조정해야 합니다. 효소 및 기질의 정의된 농도와의 반응은 분석 부피에 의존하는 상이한 결과를 줄 수 있다. 잘 당 너무 많은 효소가있는 경우, 액체의 접착은 사실 결과를 편향 할 수있다.
Michaelis-Menten 역학을 평가하기 위해 최적의 조합을 찾기 위해 100 μL, 200 μL 및 300 μL 배치에서 초기 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 유사한 양상은 운동 분석학을 위한 효소 기질 농도의 비율에 적용됩니다. 기질당 너무 많은 효소 또는 효소당 너무 많은 기질은 시스템을 선형 정상 상태 마이클리스 범위 밖으로 둔다. 이러한 조건을 최적화하려면 초기 실험이 필요합니다. 인간 FAHD1(야생형) 단백질에 대한 예시적인 조정은 섹션 8에 제공되어 운동 다이어그램을 생성합니다(예: 도 5B에제시된 바와 같이).
결정화를 위해 단백질 용액의 액적은 커버슬립의 중앙에 파이펫을 투과하고 일반적으로 완충제(예: Tris-HCl, HEPES)와 침전물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 암모늄)으로 구성된 결정화 칵테일 방울과 혼합됩니다. 황산염). 공동 결정화를 위한 억제제 용액의 액적(예: 이 프로토콜의 옥살레이트)은 선택적으로 적용될 수 있다. 커버 슬립은 결정화 칵테일을 포함하는 저수지의 우물 위에 거꾸로 배치, 실란트 오일의 도움으로잘 공기를 밀봉 (그림 6B). 이상적으로, 단백질이 용액에 남아 있는 것을 의미하는 실험의 시작 부분에 있는 투하 내의 아무 침수도 일어나지 않습니다. 저수지내의 침전물 농도가 낙하량보다 높기 때문에, 저수지와의 평형에 도달할 때까지 우물의 대기로 증발하여 물을 잃기 시작한다. 저수지로 물을 확산시키는 것은 드롭의 느린 부피 감소를 야기하고, 이는 차례로 드롭, 단백질 및 침전물 농도모두의 증가를 야기한다. 단백질 용액이 필요한 포화 상태에 도달하면 메타 안정성, 결정 성장에 따른 자발적인 핵 형성이 발생할 수 있습니다. 과포화 상태에 도달하는 것은 결정화를 위해 필요하지만 충분하지 않은 조건이다. 단백질의 결정화는 둘 다, 유리한 열역학 및 운동 조건을 필요로 하며, 결정화될 단백질의예측할 수 없는 특성에 크게 의존한다.
수정 및 문제 해결
대장균에서 단백질의 발현은 비효율적일 수 있다. 다양한 IPTG 농도, 발현 온도 및 증폭 시간(예: 몇 시간 동안 또는 추운 방에서 하룻밤 동안 실온)은 최적의 조건을 찾기 위해 각각의 새로운 단백질에 대해 테스트해야 할 수도 있습니다. 포함 체에서 단백질의 침전은 때때로 더 소수성 FAHD 단백질에 대 한 관찰. 이러한 경우에, 곤충 세포와 같은 다른 모델 시스템에서 단백질 발현이 권장되며, 포함 체는26을형성할 가능성이 적기 때문에 권장된다.
FAHD 단백질은 염분 및 보조 인자 농도뿐만 아니라 pH에 민감하기 때문에, 다른 상동체, 정형 화 및 점 돌연변이 변이체에 대한 정제 전략은 개별 설정에서 다를 수 있습니다. 기재된 정제 방법은 야생형 인간 및 마우스 FAHD1 단백질을 위해 개발된다. PH뿐만 아니라 NaCl 및 imidazole와 같은 화학 물질의 농도는 다른 등전점 (pI)을 가진 개별 단백질에 대해 조정되어야 할 수 있습니다. 또한 주의, 모든 그의태그 단백질 Ni-NTA 수 지에 잘 바인딩할 수 있습니다. Ni-NTA 컬럼에 결합하는 단백질이 비효율적이라면, NaCl 및 imidazole의 적응된 농도뿐만 아니라 Ni-NTA 실행 완충제에서의 다양한 pH 조건은 결과의 품질을 향상시키는 데 도움이 될 수 있다. 그렇지 않은 경우, Ni-NTA 단계를 건너뛰고 이온 교환 크로마토그래피의 단계로 진행하는 것은 또한 성공적인 정제 전략으로 이어질 수 있다. 단백질이 Ni-NTA 컬럼에 결합하지만 컬럼에서 용출될 수 없는 경우, 일부 mM EDTA를 첨가하면 Ni2+ 복합체를 방해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
결정화 과정에 관하여, 정규 주기 격자로 크고 복잡한 단백질 분자의 자기 조직은 운동 파라미터를 통제하기 어려운에 크게 의존하는 본질적으로 가능성 있는 프로세스이다는 것을 이해될 필요가 있습니다. 결정화에 사용되는 셋업의 작은 변화조차도 결과를 극적으로 바꿀 수 있으며 결정이 형성되지 않습니다. 단백질 순도는 일반적으로 가장 중요합니다. 엄지 손가락의 규칙으로, 심하게 과부하 SDS-PAGE 젤 다른 밴드를 표시 하지 않아야 합니다. 또한 단계가 수행되는 순서는 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 일례로, 재현성을 보장하기 위해, 종종 파이펫팅 서열을 동일하게 유지하고, 먼저 단백질을 첨가하고, 마지막으로 결정화 액적에 침전제를 추가(또는 그 반대의 경우도 마찬가지)하는 것이 필요하다. 어떤 방법을 사용하든 실험을 재현하거나 확장하려고 할 때 동일하게 유지되어야 합니다. 이 프로토콜에 따라 결정이 관찰되지 않으면 화학 적 침전물 조성물, pH, 투하 크기 및 단백질 대 침전비 비율이 작은 단위로 변할 수 있습니다. 인내와 방울에 대한 일관된 관찰은 미덕입니다.
FAHD1의 촉매 메커니즘에 대한 발언
제시된 방법은 고품질의 FAHD1 단백질을 얻기 위해 특별히 개발되었다. 이를 통해 FAHD1 결정의 성장뿐만 아니라 억제제(oxalate, PDB:6FOG)에 복잡한 FAHD1을 함유하는 결정의 엔지니어링이 가능해졌습니다. X 선 구조는 효소의 촉매 공동의 3D 아키텍처를 제공합니다. 이 결과는 이 흥미로운 효소의 촉매 기계장치에 잠재적으로 중요한 잔기의 포괄적인 설명을 설치합니다. FAHD1은 아실피루바트(아세틸피루바테, 푸마릴피루바테)를 분리할 수 있도록 먼저 기술되었다11. 나중에, FAHD1은 옥살로아세테이트12의탈카르박실라제로서도 작동한다는 것을 발견했습니다. 기판 아실피루바테와 옥살로아세테이트는 서로 다른 화학적 모이티에이트이지만, 화학적 변형은공통단일 C3-C4 결합의 전략적 분열을 기계적으로 공유하며, C3의 경우 정력적으로 촉진된다. -C4 결합 궤도는 C2-카본15의 π-궤도에 직교상태를 유지한다. 이러한 형태는 절단 과정 동안 일시적으로 형성된 C3-카르바니온의 공명 안정화를 허용한다. 상기 FAHD1 기질(oxaacacetate 및 아실피루바트)은 유연한 분자이며, 타우토머릭(keto-enol)뿐만아니라 C2-하이드레이트 형태로 존재할 수 있다(도9A). 상이한 종들 사이의 평형은 주로 사용되는 완충조성의 성질, pH 및 금속 이온의 존재에 의해 결정된다. 다음에서 우리는 FAHD1의 촉매 중심을 개시한 X 선 결정 구조물의 분석에서 영감을 받은 가설 기계론 시나리오를 토론합니다.
그림 9 : 인간 FAHD1의 촉매 메커니즘에 대한 세부 사항.
(a) 옥살로아세테이트는 주로Z-에놀 형태24에서중성 용액뿐만 아니라 결정성 상태이다. 그러나, 생리적 pH 조건 하에서 2-케토 형태는 우세한 표현(25)이다. (B) mg-바운드 옥살로아세테이트(왼쪽)와 아실피루바트(오른쪽, R1을 유기적 나머지로, 적색 화살표는 인접한 안정화된 물 분자의 핵애호가 공격을 나타낸다)를 가진 hFAHD1 캐비티(15)의 화학적 스케치(토론 참조). (C) FAHD1의 decarboxylase (bto c) 및 하이드라제 (b’to c) 메커니즘에서 C 3-C4 분열에 대한 선호 된 적합성의 비교 : 두 공정 모두 Mg 복합화 피루바테 -enolate를 초래합니다 (토론 참조). 중간값 b와 b’는 패널 B에 스케치된 대로 Q109까지 안정화될 것으로 예상됩니다(토론 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FAHD1의 데카르복실라제 활동
옥살로아세테이트는 주로Z-에놀 형태24에서중성 용액뿐만 아니라 결정성 상태로 존재한다. 그러나 생리학적 pH 조건(pH 7.4에서 완충조건)에서 2-케토 형태는 옥살로아세테이트 25(도9A)의우세한 표현이며, 박균화(27)의 전제조건이 아님을 나타내었으나, . 참고로, Mg2+ 이온은 7.4 이하의 pH 또는28이하의 옥살레아세테이트 종의 비율에 영향을 미치지 않습니다. FAHD1의 촉매 중심에 옥살로아세테이트 케토 형태의 전치(복합효소의 결합 된 옥살레이트에 의해 유도(PDB: 6FOG 15))는 결합된 옥살로아세테이트(15)의형태 조절자로서 잔류물 Q109를 밝혀낸다. 또 다른 조15에설명된 바와 같이, Q109의 카르바모일 그룹에 수소 결합은 C2-C3 결합 주위의 회전으로부터 발생하는 옥살로아세테이트 형태형성을 안정화한다(도9B,좌측 패널). 이러한 회전의 결과로서,C3-C4 결합(갈라질 수 있음)은 C2-카보닐의 π 궤도에 대한 직교 성향에 근접한 것을 채택한다(도 9C). 이산화탄소를 방출할 수 있습니다. 이 과정의 주요 생성물은 공진 안정화 된 피루브의 Mg-enolate일 것입니다. 옥살로아세테이트-Mg 복합체의 조사에서 에놀레이트가 가장 안정한 복합체(28,29)를형성하는 것으로 알려져 있다. MG-피루바트-복합체에 대한 비교 가능한 안정성을 가정하면 FAHD1의 보조 인자가 차단될 수 있지만, 리신 잔류물 K123은 평형에서 피루바테-에놀레이트(pyruvate-enolate)를 프로토질화하여 공동인자(15)의 손실을 금지할 수 있다.
주어진 해석은 FAHD1의 촉매 ODx 기능에 있는 명백한 중간으로 pyruvate enol를 건의합니다. 가설 모델의 이 단계에서 실험 데이터는 제품을 출시하기 위해 닫힌 뚜껑을 열어야 하는 이유에 대한 추가 표시를 제공하지 않습니다. 그러나 제안된 메커니즘이 제품에 의한 효소 억제처럼 보인다고 추론할 수 있습니다: 결정 구조는 잔기 H30 및 E33에 의해 FAHD1 촉매 센터를 향한 방향 방향으로 유지된 보존된 물 분자를 나타낸다. 짧은 나선(15)이는 리간드 결합 및 뚜껑 폐쇄시 유도된다. 1 차 에놀이 enolate와 평형에 머무르면, 안정화된 에놀레이트 공진은 물 분자에 의해 pyruvate에 담금질될 수 있었습니다. 생성된 하이드록실은 뚜껑이 열리는 Mg-보조인자로부터 피루브를 대체할 수 있을 것이다. 마지막으로, 촉매 센터는 미토콘드리아 환경에서 복원될 것입니다. 이 가설 시나리오에서, 공동 물 분자는 각각 산으로 작동할 것이다.
FAHD1의 하이드로라제 활동
효소의 하이드라아제 활성은 암시적으로 하이드록실 뉴클레오필의 중간 형성을 필요로 한다. 이 기계장치는 일반적으로 산 염기 촉매 활동과 조합에서 있습니다. 반응의 과도 상태는 공동에서 중요한 아미노산 측사슬에 의한 형태 조절을 통해 제조되어야 한다. 데카르복실라제 기능에 대한 논의와 유사하게, 2-케토 형태의 효소 결합 아실피루베제는 Q109에 4-카보닐 산소의 수소 결합에 의해 형태 제어하에 놓일 것이다(도9B,우측 패널). 옥살레이트 결합 FAHD1(PDB:6FOG)의 결정 구조는 짧은 나선15에제시된 잔류물 H30 및 E33에 의해 FAHD1 촉매 중심을 향한 방향 방향으로 유지된 보존된 물 분자를 나타낸다. E33-H30 다이드는 방향성 위치수를 탈보하는 능력이 있으며, 생성된 하이드록실은 Q10915에의해 시형 제어하에 제시된 아실피루바트의 4-카보닐을 공격하는 이상적인 처리에 있다.
참고로, FAH18에대해 유사한 메커니즘이 제안되었습니다. 하이드록실 뉴클레오필에 의한 공격은 옥시내온 종을 초래할 것으로 예상되며, 이는궤도 제어 C3-C4 결합 절단에 안정화된다(도9C). 이 모델에서,C3-C4 결합 회전(도9C)은 도 9B에 도시된 형성된 하이드록실에 의한 핵성 공격 후에 발생한다(즉, 결합 절단을 위한 아실피루브를 준비한다). 주요 제품은 아세트산과 Mg-피루바테 에놀레이트일 것입니다. 이 가설 시나리오에서, 아세트산은 피루바테에 에놀을 담금질하고 이후에 제품의 변위를 지원할 수 있었다. 7.5의 pH 이상및 Mg 이온의 존재, 아실피루바트는 케토-및 에놀 형태 사이의 평형에 존재하며, 후자는 약간의 선호도30에서존재한다. 대부분의 아마 두 형태는 후속 뚜껑 폐쇄에서 FAHD1의 공동 인자에 바인딩할 수 있습니다. 효소에 의한 에놀릭 아실피루브염 의 처리는 에놀 형태의 평평한 구조로 인해 방해를 받고 있다. C3-C4 분열은 공진 안정화 없이 비닐 카바니를 초래할 것이다.
따라서, 아실 카보닐 상에서 하이드록실 뉴클레오필의 공격을 준비하기 위한 촉매 케톤화 단계를 제안한다. 그러나 케톤화의 이 과정은 FAHD1 잔류물로 양성자 전위를 제어해야 하며, 이는 FAHD1에 내재된 이소머라아아제 활성을 기인합니다. Mg-바운드 에놀 수소의 산도는 비복합형28에비해 1만배 증가한 것으로 보고되고 있다. Mg 바운드 에놀 형태의 분해는 비 프로톤화 된 K123에 의해 가능할 것이다. K123의 분해는 D102의 카복실레이트에 의해 지원될 수 있다. 잔류물 D102-K47-K123에 의해 형성된 수소 결합 네트워크는 FAHD115의촉매 중심에 필요한 양성자 릴레이로 작동할 수 있습니다. 이러한 형성된 중간 에놀레이트는 기판(15)의 케톤화 하에 E33-H30-H20트라이어드에 의해 담금질될 수 있었다. 2-케토 형태는 Q109의 형태 제어하에 올 것이고, 수반되는 형성된 하이드록실은 아실 카보닐을 공격할 것이다. 요약된 토론은 공동 형성 잔기의 상호 작용을 통해 산과 염기 사이를 전환하기 위한 물 분자에 관하여 FAHD1의 통제를 의미합니다.
방법의 향후 응용 프로그램 또는 방향
여기에 설명된 메서드의 향후 응용 프로그램은 많습니다. FAH 슈퍼 패밀리의 원핵 생물의 과다 여전히 기능적 특성화를 기다리고 있습니다. 알려진 FAH 수퍼패밀리 구성원의 촉매 활동에 대한 사용 가능한 정보조차도 부족하며, 대부분의 경우 실험 데이터보다는 이론적 가정에 근거합니다. 원핵 요법 FAH 수퍼 패밀리 구성원에 대해 여기에 기술된 방법의 적용은 세균학에서 특정 한 연구 관심사에 따라 달라집니다. 한편, 진핵 FAH 수퍼패밀리 회원들이 다양한 세포 구획(예: 시토솔 대 미토콘드리아)에서 필수적인 역할을 한다는 최근의 시연은 이러한 단백질을 더 잘 특성화할 필요성을 강조합니다(그 중 3개는 지금까지 확인), 특히 현재 데이터는 일부 특성화되지 않은 단백질이 미토콘드리아 생물학, 노화 연구 및 암 연구의 맥락에서 다른 기능을 수행 할 수 있음을 시사하기 때문에. 이러한 진핵 FAH 수퍼패밀리 구성원의 완전한 분자 및 생리학적 특성은 생물 의학 분야에서 현대 연구의 주요 분야에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있다고 제안된다. FAHD1의 메커니즘에 대 한 더 많은 연구 (그리고 관련 효소) FAHD1의 이중 기능의 기본 메커니즘을 더 잘 이해 하는 데 필요한, 아직 완전히 명확 하지. FAHD1 돌연변이체, NMR-조사 및 억제제 복합체에 대한 구조적 연구를 통해 FAHD1이 유능해 보이는 진정한 기계적 시나리오를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 더욱이, Mg-코팩터에 결합할 수 있는 에놀 모방의 컴퓨터 지원 디자인은 결국 FAHD1의 강력한 억제제로 이끌어 낼 것이다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 애너벨라 피틀의 전문적인 기술 지원과 Haymo Pircher의 파일럿 방법 개발에 매우 감사드립니다.
BL21(DE3) pLysS competent E. coli | Promega | L1195 | High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site |
pET E. coli T7 Expression Vectors | MERCK | – | http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav |
0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
15 mL Falcon | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
50 mL Falcon | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 30622-758 | VIS transparent cuvettes |
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 47727-024 | UV/VIS transparent cuvettes |
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | ROTH | 2316 | chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system |
imidazole | ROTH | X998 | chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin |
Glass Econo-Column Columns | Bio-Rad | – | http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod |
chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration |
kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration |
ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration |
Ultra-15, MWCO 10 kDa | Sigma-Aldrich | Z706345 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT |
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units | Sigma-Aldrich | Z677108 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de®ion=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2 |
oxaloacetic acid | Sigma-Aldrich | O4126 | TCA metabolite |
sodium oxlalate | Sigma-Aldrich | 71800 | a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes |
Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9277 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable |
Ni-NTA agarose | Thermo-Fischer | R90101 | a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence |
96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616 |
ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
HiTrap Phenyl HP column | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630 |
Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723 |
Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608 |
HiLoad Superdex column 75 pg (G75) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800 |
HiLoad Superdex column 200 pg (G200) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283 |
TECAN microplate reader | TECAN Life Sciences | – | https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers |
acetylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
benzoylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
VDX™ plate (24 wells) | Hampton | HR3-142 | 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
paraffin oil | Hampton | HR3-411 | used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
coverslips (22 mm) | Karl Hecht KG | 14043 | coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
Luria broth (LB) medium | self-prepared | – | a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar |
NZCYM medium | self-prepared | – | a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4 |
Luria broth (LB) agarose plates | self-prepared | – | autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ |
Ni-NTA running buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Ni-NTA elution buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
HIC running buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7 |
HIC running buffer AS | self-prepared | – | HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0 |
Mono S low salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Mono S high salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
Mono Q low salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0 |
Mono Q high salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0 |
G75 / G200 running buffer | self-prepared | – | 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4 |
enzyme assay buffer | self-prepared | – | 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2 |
protein crystallization buffer | self-prepared | – | G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT |
reservoir solution for crystallization | self-prepared | – | 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2 |