Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen
Summary
Hier präsentieren wir ein ex-vivo gemischtes monolayer Kultursystem zur Erforschung der Migration menschlicher Gliomzellen (hGC) in Echtzeit. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen hGCs und myelinierten und nicht myelinierten Axonen innerhalb einer abgeteilten Kammer zu beobachten.
Abstract
Glioblastom ist eine der aggressivsten menschlichen Krebsarten aufgrund der umfangreichen zellulären Heterogenität und der Migrationseigenschaften von hGCs. Um die molekularen Mechanismen, die der Gliomzellmigration zugrunde liegen, besser zu verstehen, ist die Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen hGCs und Axonen innerhalb der Tumormikroumgebung zu untersuchen, unerlässlich. Um diese zelluläre Interaktion zu modellieren, haben wir ein Gemischtes Kultursystem entwickelt, das aus hGCs und dorsalen Wurzelganglien (DRG) Axon-Oligodendrozyten-Kokulturen besteht. DRG-Kulturen wurden ausgewählt, weil sie effizient isoliert werden können und die langen, umfangreichen Projektionen bilden können, die für Migrationsstudien dieser Art ideal sind. Gereinigte Rattenoligodendrozyten wurden dann auf gereinigten Ratten-DRG-Axonen zugegeben und zu Myelinat induziert. Nach der Bestätigung der Bildung von kompaktem Myelin wurden hGCs schließlich der Kokultur hinzugefügt und ihre Wechselwirkungen mit DRG-Axonen und Oligodendrozyten wurden in Echtzeit mittels Zeitraffermikroskopie überwacht. Unter diesen Bedingungen bilden hGCs tumorähnliche Aggregatstrukturen, die GFAP und Ki67 exprimieren, sowohl myelinierte als auch nicht myelinierte axonale Spuren migrieren und mit diesen Axonen durch die Bildung von Pseudopodien interagieren. Unser Ex-vivo-Cokultursystem kann verwendet werden, um neuartige zelluläre und molekulare Mechanismen der hGC-Migration zu identifizieren und könnte potenziell für In-vitro-Arzneimittel-Wirksamkeitstests verwendet werden.
Introduction
Glioblastom ist einer der aggressivsten und tödlichsten Tumoren des menschlichen Gehirns. Der aktuelle Standard der Behandlung umfasst die chirurgische Resektion des Tumors gefolgt von Strahlung1 plus gleichzeitige und adjuvante Verabreichung von Temozolomid2. Selbst mit diesem multitherapeutischen Ansatz ist ein Tumorrezidiv unvermeidlich3. Dies ist teilweise auf die ausgedehnte Migrationsnatur der Tumorzellen zurückzuführen, die in das Gehirnparenchym eindringen und mehrere fingerähnliche Projektionen innerhalb des Gehirns4 erzeugen, die eine vollständige Resektion unwahrscheinlich machen.
In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Aggressivität des Glioblastoms zum Teil auf das Vorhandensein einer Population von Krebsstammzellen innerhalb der Tumormasse5,6zurückzuführen ist, die ein hohes Migrationspotenzialaufweisen 7,8, Resistenz gegen Chemotherapie und Bestrahlung9,10 und die Fähigkeit, sekundäre Tumoren zu bilden11. GSCs sind in der Lage, ursprüngliche polyklonale Tumoren zu rekapitulieren, wenn xenografted zu nackten Mäusen5.
Trotz des Wissens über den genetischen Hintergrund von Glioblastomen werden Studien zur Gliomzellmigration (GC) derzeit durch einen Mangel an effizienten In-vitro- oder In-vivo-Migrationsmodellen behindert. Bemerkenswert ist, dass, während gliomzellaxonale Wechselwirkungen, moduliert durch zelluläre und Umweltfaktoren, ein Kernbestandteil der Gliominvasion sind, gibt es nach unserem Wissen derzeit kein experimentelles System mit der Fähigkeit, diese Wechselwirkungen zu modellieren12,13,14. Um diesen Mangel zu beheben, entwickelten wir ein ex vivo-Kultursystem von primären hGCs, die mit gereinigten DRG-Axon-Oligodendrozyten kokultiviert werden, was zu einer erhöhten Expression differenzierter Tumormarker sowie einer umfangreichen Migration und Interaktion von hGCs mit myelinierten und nicht myelinierten Fasern führt. Diese ex vivo-Plattform eignet sich aufgrund ihres unterteilten Layouts für die Erprobung der Auswirkungen neuartiger Therapeutika auf hGC-Migrationsmuster.,
Protocol
Representative Results
Discussion
Migrationsstudien für hGCs können mit Boyden-Kammersystemen oder Scratch-Assays durchgeführt werden. Während diese Experimente jedoch keine Informationen über die Wechselwirkungen von Tumorzellen mit anderen umgebenden Geweben geben, kann das gegenwärtige System GC-Wechselwirkungen mit myelinierten und nicht myelinierten Fasern rekapitulieren. Darüber hinaus wurden zur Untersuchung der Tumorbildung und Endpunktmigration, organotypischer Scheibenkulturen des Nagetierhirns oder der In-vivo-Implantation von Gliomzell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Department of Neurosurgery, Brown University to N.T. unterstützt.
Materials
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
Riferimenti
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