Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all’interno di una camera compartimentata.
Il glioblastoma è uno dei tumori umani più aggressivi a causa dell’estensiva eterogeneità cellulare e delle proprietà migratorie degli HCC. Per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base della migrazione delle cellule glioma, è essenziale la capacità di studiare l’interazione tra HG e assoni all’interno del microambiente tumorale. Per modellare questa interazione cellulare, abbiamo sviluppato un sistema di coltura mista costituito da hGC e gangli della radice dorsale (DRG) co-culture asson-oligodendrocite. Le culture DRG sono state selezionate perché possono essere isolate in modo efficiente e possono formare le proiezioni lunghe ed estese che sono ideali per studi di migrazione di questo tipo. Gli oligodendrociti purificati sono stati poi aggiunti agli assoni DRG di ratti purificati e indotti in mielinati. Dopo aver confermato la formazione di mielina compatta, gli hGC sono stati finalmente aggiunti alla co-coltura e le loro interazioni con gli assoni DRG e gli oligodendrociti sono state monitorate in tempo reale utilizzando la microscopia time-lapse. In queste condizioni, gli HGC formano strutture aggregate simili a tumori che esprimono GFAP e Ki67, migrano lungo tracce assonali mielinate e non mielinate e interagiscono con questi assoni attraverso la formazione di pseudopodi. Il nostro sistema di co-cultura ex vivo può essere utilizzato per identificare nuovi meccanismi cellulari e molecolari di migrazione hGC e potrebbe potenzialmente essere utilizzato per test di efficacia dei farmaci in vitro.
Il glioblastoma è uno dei tumori più aggressivi e letali del cervello umano. L’attuale standard di cura comprende la resezione chirurgica del tumore seguita da radiazione1 più la somministrazione concomitante e adiuvante di temozolomide2. Anche con questo approccio multiterapeutico, la recidiva tumorale è inevitabile3. Ciò è in parte dovuto alla natura migratoria estesa delle cellule tumorali, che invadono il parenchyma cerebrale creando più proiezioni simili a dita all’interno del cervello4 che rendono improbabile la resezione completa.
Negli ultimi anni, è diventato evidente che l’aggressività del glioblastoma è dovuta, in parte, alla presenza di una popolazione di cellule staminali tumorali all’interno della massa tumorale5,6, che presentano un alto potenziale migratorio7,8, resistenza alla chemioterapia e radiazioni9,10 e la capacità di formare tumori secondari11. Le GSC sono in grado di ricapitolare i tumori originali del policlonale quando lo xenotrapianto viene ai topi nudi5.
Nonostante la ricchezza di conoscenze sul background genetico dei glioblastomi, gli studi sulla migrazione delle cellule glioma (GC) sono attualmente ostacolati dalla mancanza di modelli di migrazione in vitro o in vivo efficienti. In particolare, mentre le interazioni glioma-assonali modulate da fattori cellulari e ambientali sono una componente fondamentale dell’invasione del glioma, a nostra conoscenza non esiste attualmente un sistema sperimentale con la capacità di modellare queste interazioni12,13,14. Per affrontare questa carenza, abbiamo sviluppato un sistema di coltura ex vivo di hGC primari co-coltivati con fibre purificate di assoni-oligodendrociti che si traduce in un’espressione elevata di marcatori tumorali differenziati, nonché un’estesa migrazione e interazione di hGC con fibre mielinate e non mielinated. Questa piattaforma ex vivo, grazie al suo layout compartimentato, è adatta per testare gli effetti di nuove terapie sui modelli di migrazione hGC.
Gli studi di migrazione per hGC possono essere eseguiti utilizzando sistemi camera Boyden o saggi scratch. Tuttavia, mentre questi esperimenti non riescono a fornire alcuna informazione per quanto riguarda le interazioni delle cellule tumorali con altri tessuti circostanti, l’attuale sistema può ricapitolare le interazioni GC con fibre mielinate e non mielinate. Inoltre, per studiare la formazione tumorale e la migrazione all’estremità, le colture di fette organotipiche del cervello dei roditori o l’impianto in vivo di…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da fondi interni del Dipartimento di Neurochirurgia, Brown University a N.T.
100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
Biotin | Sigma | B4639 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
D-Glucose | Sigma | G5146 | |
DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
DNase I | Sigma | D7291 | |
Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
EBSS | Sigma | E7510 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
FUDR | Sigma | F0503 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
NAC | Sigma | A8199 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
Ordinary forceps | |||
P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
Papain | Worthington | LS003126 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
Transferrin | Sigma | T2036 | |
Uridine | Sigma | U3003 |