في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة
Summary
هنا نقدم السابقين فيفو مختلطة نظام الثقافة أحاديه الطبقة لدراسة الهجرة الخلية البشرية الورم (hGC) في الوقت الحقيقي. يوفر هذا النموذج القدرة علي مراقبه التفاعلات بين عارضه والمحاور النخاعية وغير النخاعية داخل غرفه مجزاه.
Abstract
الورم المفلطح هو واحد من السرطانات البشرية الأكثر عدوانيه بسبب التغاير الخلوي واسعه النطاق وخصائص الهجرة من عارضه. من أجل فهم أفضل للأليات الجزيئية الكامنة وراء هجره خلايا الورم الدبقي ، من الضروري القدرة علي دراسة التفاعل بين عارضه والمحاور داخل البيئة المجهرية للورم. من أجل نمذجة هذا التفاعل الخلوي ، قمنا بتطوير نظام الثقافة المختلطة التي تتكون من عارضه والظهرية الجذر عقد قاعدي (drg) الثقافات المشتركة اكسون-oligodendrocyte. تم اختيار الثقافات DRG لأنها يمكن ان تكون معزولة بكفاءة ويمكن ان تشكل التوقعات طويلة وواسعة والتي تعتبر مثاليه للدراسات الهجرة من هذا النوع. ثم تمت أضافه الفئران المنقية oligodendrocytes علي الفئران المنقية drg محاور والمستحثة إلى النخاع. بعد التاكد من تشكيل الميالين المدمجة ، تمت أضافه عارضه أخيرا إلى الثقافة المشتركة وتم رصد تفاعلاتها مع محاور drg و oligodendrocytes في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الزمني الفاصل. وفي ظل هذه الظروف ، عارضه شكل البنية التجميعية الشبيهة بالورم التي تعبر عن GFAP و Ki67 ، وتهاجر علي طول المسارات المحورية النخاعية وغير النخاعية وتتفاعل مع هذه المحاور من خلال تشكيل الكاذبة. ويمكن استخدام نظام الثقافة المشتركة السابقة لدينا للتعرف علي أليات الخلوية والجزيئية الجديدة للهجرة hGC ويمكن استخدامها لاختبار فعاليه المخدرات في المختبر.
Introduction
الورم المفلطح هو واحد من الأورام الأكثر عدوانيه وفتكا في الدماغ البشري. ويشمل المعيار الحالي للرعاية الاستئصال الجراحي للورم تليها الإشعاع1 زائد المصاحبة والاداريه المساعد لtemozolomide2. حتى مع هذا النهج متعدد العلاجية, تكرار الورم لا مفر منه3. ويرجع ذلك جزئيا إلى طبيعة الهجرة واسعه النطاق من الخلايا السرطانية ، التي تغزو الدماغ حمه خلق العديد من التوقعات مثل الاصبع داخل الدماغ4 التي تجعل استئصال كامل من غير المحتمل.
في السنوات الاخيره ، أصبح من الواضح ان العدوانية من الورم الدبلاستومي يرجع ، في جزء منه ، إلى وجود السكان من الخلايا الجذعية السرطانية داخل كتله الورم5،6، والتي تظهر احتمالات الهجرة عاليه7،8، مقاومه العلاج الكيميائي والإشعاع9،10 والقدرة علي تشكيلالأورامالثانوي GSCs هي قادره علي تلخيص الأورام متعددة الأضلاع الاصليه عندما xenografted إلى الفئران عاريه5.
وعلي الرغم من ثروة المعرفة المتعلقة بالخلفية الوراثية للأورام السرطانية ، فان الدراسات المتعلقة بالهجرة الخلوية (GC) تعرقل حاليا بسبب نقص الكفاءة في المختبر أو في نماذج الهجرة المجرية. وعلي وجه الخصوص ، في حين ان التفاعلات الخلوية المحورية المكونة من قبل العوامل الخلوية والبيئية تشكل عنصرا أساسيا في غزو الدروما ، فان معرفتنا لا يوجد حاليا اي نظام تجريبي مع القدرة علي نمذجة هذه التفاعلات12،13،14. لمعالجه هذا النقص ، قمنا بتطوير نظام الثقافة المجرية السابقة لعارضه الاوليه المشتركة مع المنقي DRG اكسون-oligodendrocytes التي تؤدي إلى ارتفاع التعبير عن علامات الورم المتمايزة ، فضلا عن الهجرة واسعه النطاق والتفاعل من عارضه مع ألياف النخاعية وغير النخاعي هذه المنصة المجرية السابقة ، بسبب تخطيطها مجزاه ، هو مناسبه لاختبار اثار المداواة الرواية علي أنماط الهجرة hGC.,
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن اجراء دراسات الهجرة لعارضه باستخدام أنظمه غرفه Boyden أو اختبارات الصفر. ومع ذلك ، في حين ان هذه التجارب تفشل في إعطاء اي معلومات بشان تفاعلات الخلايا السرطانية مع الانسجه المحيطة الأخرى ، يمكن للنظام الحالي تلخيص تفاعلات GC مع ألياف النخاعية وغير النخاعية. وعلاوة علي ذلك ، لدراسة تكوين…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل الصناديق الداخلية لقسم جراحه المخ والأعصاب ، جامعه براون إلى N.T.
Materials
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
Riferimenti
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Ricerca sul cancro. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. . Glioblastoma. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
