Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen
Summary
Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc’s en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.
Abstract
Glioblastoma is een van de meest agressieve menselijke kankers als gevolg van uitgebreide cellulaire heterogeniteit en de migratie-eigenschappen van hGCs. Om de moleculaire mechanismen voor de onderliggende glioom Cell migratie beter te begrijpen, is een vermogen om de interactie tussen Hgc’s en axonen binnen de tumor micro omgeving te bestuderen essentieel. Om deze cellulaire interactie te modelleren, ontwikkelden we een gemengd cultuur systeem bestaande uit hGCs en dorsale wortel ganglia (DRG) axon-oligodendrocyte co-culturen. DRG-culturen werden geselecteerd omdat ze efficiënt geïsoleerd kunnen worden en de lange, uitgebreide projecties kunnen vormen die ideaal zijn voor migratie studies van deze aard. Gezuiverde rat oligodendrocyten werden vervolgens toegevoegd aan gezuiverde rat DRG axonen en geïnduceerd aan myelinaat. Na het bevestigen van de vorming van compacte myeline, werden Hgc’s uiteindelijk toegevoegd aan de co-cultuur en hun interacties met DRG axonen en oligodendrocyten werd in real-time gemonitord met behulp van timelapse-microscopie. Onder deze omstandigheden vormen Hgc’s tumor-achtige geaggregeerde structuren die GFAP en Ki67 uitdrukken, migreren langs zowel myelgefluoreerde als niet-myelotische axonale tracks en communiceren met deze axonen door de vorming van pseudopodia. Ons ex vivo-co-cultuur systeem kan worden gebruikt om nieuwe cellulaire en moleculaire mechanismen van hGC-migratie te identificeren en kan mogelijk worden gebruikt voor in-vitro geneesmiddelen werkzaamheids testen.
Introduction
Glioblastoma is een van de meest agressieve en dodelijke tumoren van het menselijk brein. De huidige standaard voorzorg omvat chirurgische resectie van de tumor gevolgd door straling1 plus gelijktijdige en adjuvante toediening van temozolomide2. Zelfs met deze multi-therapeutische aanpak, tumor herhaling is onvermijdelijk3. Dit is deels te wijten aan de uitgebreide migratie aard van de tumorcellen, die de hersen parenchym het creëren van meerdere vinger-achtige projecties binnen de hersenen4 die volledige resectie onwaarschijnlijk maken.
In de afgelopen jaren is het duidelijk geworden dat de agressiviteit van multiform glioblastoom deels te wijten is aan de aanwezigheid van een populatie van kanker stamcellen binnen de tumor massa6,5, dieeen hoog migratie potentieel vertonen7,8, resistentietegen chemotherapie en straling9,10 en de mogelijkheid om secundaire tumoren te vormen11. GSCs zijn geschikt voor het recapituleren van originele polyklonale tumoren bij xenografted aan naakte muizen5.
Ondanks de rijkdom aan kennis met betrekking tot de genetische achtergrond van glioblastomas, worden studies over glioom Cell (GC) migratie momenteel gehinderd door een gebrek aan efficiënte in vitro of in vivo migratie modellen. Met name, terwijl glioom Cell-axonale interacties gemoduleerd door cellulaire en omgevingsfactoren zijn een kerncomponent van glioom invasie, naar onze kennis is er momenteel geen experimenteel systeem met de mogelijkheid om het model van deze interacties12,13,14. Om dit gebrek aan te pakken, ontwikkelden we een ex vivo cultuur systeem van primaire hGCs co-gekweekt met gezuiverde DRG axon-oligodendrocyten die resulteert in verhoogde expressie van gedifferentieerde tumormarkers evenals uitgebreide migratie en interactie van Hgc’s met myelfluoren niet-myelgefluoreerde vezels. Dit ex vivo platform, vanwege zijn gecompartimengd lay-out, is geschikt voor het testen van de effecten van nieuwe Therapeutics op hGC-migratiepatronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migratie studies voor Hgc’s kunnen worden uitgevoerd met behulp van Boyden Chamber Systems of Scratch assays. Echter, terwijl deze experimenten niet om enige informatie met betrekking tot de interacties van tumorcellen met andere omringende weefsels geven, het huidige systeem kan GC interacties met myelineerde en niet-myelinehoudende vezels recapituleren. Bovendien, om tumorvorming en eindpunt migratie te bestuderen, zijn organotypische segment culturen van het knaagdier brein of in vivo implantatie van glioom cellen in …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door interne fondsen van het Department of neuro Surgery, Brown University to N.T.
Materials
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
Riferimenti
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Ricerca sul cancro. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. . Glioblastoma. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
