Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal
Summary
Aquí presentamos un sistema de cultivo monocapa mixto ex-vivo para el estudio de la migración de células de glioma humano (hGC) en tiempo real. Este modelo proporciona la capacidad de observar interacciones entre hGCs y axones mielinados y no mielinizados dentro de una cámara compartimentada.
Abstract
El glioblastoma es uno de los cánceres humanos más agresivos debido a la extensa heterogeneidad celular y las propiedades migratorias de los hGCs. Con el fin de comprender mejor los mecanismos moleculares subyacentes a la migración de células glioma, es esencial una capacidad para estudiar la interacción entre los hGCs y los axones dentro del microambiente tumoral. Con el fin de modelar esta interacción celular, desarrollamos un sistema de cultivo mixto que consiste en hGCs y ganglios de raíz dorsal (DRG) co-cultivos de axondrocitos. Las culturas DRG fueron seleccionadas porque pueden ser aisladas eficientemente y pueden formar las proyecciones largas y extensas que son ideales para estudios migratorios de esta naturaleza. Luego se añadieron oligodendrocitos de rata purificados en axones DRG de rata purificada e inducidos a mielinato. Después de confirmar la formación de mielina compacta, los hG ctuó finalmente se añadieron al cocultivo y sus interacciones con axones DRG y oligodendrocitos fueron monitoreados en tiempo real usando microscopía de lapso de tiempo. En estas condiciones, los hGCs forman estructuras agregadas similares a tumores que expresan GFAP y Ki67, migran a lo largo de pistas axonales mielinadas y no mielinizadas e interactúan con estos axones a través de la formación de pseudopodia. Nuestro sistema de cocultivo ex vivo se puede utilizar para identificar nuevos mecanismos celulares y moleculares de la migración de hGC y podría utilizarse potencialmente para pruebas in vitro de eficacia de fármacos.
Introduction
El glioblastoma es uno de los tumores más agresivos y letales del cerebro humano. El estándar actual de atención incluye la resección quirúrgica del tumor seguida de la radiación1 más la administración concomitante y adyuvante de temozolomida2. Incluso con este enfoque multiterapéutico, la recurrencia tumoral es inevitable3. Esto se debe en parte a la naturaleza migratoria extensa de las células tumorales, que invaden el parénquima cerebral creando múltiples proyecciones similares a los dedos dentro del cerebro4 que hacen improbable la resección completa.
En los últimos años, se ha puesto de manifiesto que la agresividad del glioblastoma se debe, en parte, a la presencia de una población de células madre cancerosas dentro de la masa tumoral5,6,que presentan un alto potencial migratorio7,8,resistencia a la quimioterapia y la radiación9,10 y la capacidad de formar tumores secundarios11. Los SSG son capaces de recapitular tumores policlonales originales cuando se xenoinjertan en ratones desnudos5.
A pesar de la riqueza de conocimientos sobre los antecedentes genéticos de los glioblastomas, los estudios sobre la migración de células gliomas (GC) se ven obstaculizados actualmente por la falta de modelos eficientes de migración in vitro o in vivo. En particular, mientras que las interacciones célula-axonal glioma moduladas por factores celulares y ambientales son un componente central de la invasión del glioma, hasta nuestro conocimiento actualmente no existe un sistema experimental con la capacidad de modelar estas interacciones12,13,14. Para hacer frente a esta deficiencia, desarrollamos un sistema de cultivo ex vivo de hGCs primarios co-cultivados con axon-oligodendrocitos DRG purificados que resulta en la expresión elevada de marcadores tumorales diferenciados, así como una amplia migración e interacción de hGCs con fibras mielinadas y no mielinizadas. Esta plataforma ex vivo, debido a su disposición compartimentada, es adecuada para probar los efectos de las nuevas terapias en los patrones de migración de hGC.,
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios de migración para hGCs se pueden realizar mediante el uso de sistemas de cámara Boyden o ensayos de arañazos. Sin embargo, mientras que estos experimentos no proporcionan ninguna información sobre las interacciones de las células tumorales con otros tejidos circundantes, el sistema actual puede recapitular las interacciones de GC con fibras mielinadas y no mielinizadas. Además, para estudiar la formación de tumores y la migración de punto final, cultivos de rodajas organotípicas del cerebro de roedo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos internos del Departamento de Neurocirugía de la Universidad De Brown a N.T.
Materials
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
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