Summary
Aqui apresentamos um protocolo para a geração espontânea de neuroesferas enriquecidas em células progenitoras neurais de neurônios chapeados de alta densidade. Durante a mesma experiência, quando os neurônios são chapeados em uma densidade mais baixa, o protocolo igualmente conduz às culturas preliminares prolongadas do neurônio de rato.
Abstract
A cultura primária do neurão é uma técnica essencial no campo da neurociência. Para obter insights mecanísticos mais profundos sobre o cérebro, é essencial ter um modelo in vitro robusto que pode ser explorado para vários estudos de neurobiologia. Embora as culturas preliminares do neurônio (isto é, culturas hippocampal a longo prazo) forneceram cientistas com modelos, não representa ainda a complexidade da rede do cérebro completamente. Na esteira dessas limitações, um novo modelo surgiu usando neuroesferas, que tem uma semelhança mais estreita com o tecido cerebral. O protocolo atual descreve o chapeamento de densidades elevadas e baixas de neurônios corticais e hippocampal misturados isolados do embrião do dia embrionário 14-16 ratos de Sprague Dawley. Isto permite a geração de neuroesferas e a cultura preliminar a longo prazo do neurônio como duas plataformas independentes para conduzir uns estudos mais adicionais. Este processo é extremamente simples e rentável, pois minimiza várias etapas e reagentes anteriormente considerados essenciais para a cultura do neurônio. Este é um protocolo robusto com requisitos mínimos que podem ser realizados com resultados alcançáveis e mais utilizados para uma diversidade de estudos relacionados à neurociência.
Introduction
O cérebro é um circuito intrincado de células neuronais e não-neuronais. Durante anos, os cientistas têm tentado obter informações sobre esta maquinaria complexa. Para isso, os neurocientistas recorreram inicialmente a várias linhagens celulares transformadas em nervo para investigações. No entanto, a incapacidade dessas linhagens de células clonais de formar conexões sinápticas fortes e axônios ou dendritos adequados mudaram o interesse científico para as culturas primárias do neurão1,2. O aspecto mais excitante da cultura do neurônio primário é que ele cria uma oportunidade para observar e manipular os neurônios vivos3. Além disso, é menos complexa em comparação com o tecido neural, o que o torna um candidato ideal para estudar a função e o transporte de várias proteínas neuronais. Recentemente, vários desenvolvimentos nas áreas de microscopia, genômica e proteômica têm gerado novas oportunidades para os neurocientistas explorarem as culturas neurais4.
As culturas primárias permitiram que os neurocientistas explorem os mecanismos moleculares por trás do desenvolvimento neural, analisem várias vias de sinalização neural e desenvolvam uma compreensão mais coerente da sinsicose. Embora uma série de métodos relataram culturas de neurônios primários (principalmente a partir da origem hipocampal5,6,7),um protocolo unificado com um meio quimicamente definido que permite a cultura de longo prazo de neurônios é ainda necessário. Entretanto, os neurônios chapeados em uma baixa densidade são observados o mais frequentemente, que não sobrevivem a longo prazo, provavelmente devido à falta do apoio trófico8 que é fornecido pelos neurônios adjacentes e pelas pilhas glial. Alguns métodos sugeriram até mesmo a coculturação dos neurônios primários com células gliais, onde as células gliais são usadas como uma camada de alimentador9. Entretanto, as pilhas glial levantam muitos problemas devido a seu overgrowth, que substituem às vezes o crescimento neuronal10. Assim, considerando os problemas acima, é necessário um protocolo de cultura neural primária mais simples e rentável, que pode ser usado tanto por neurobiólogos quanto por neuroquímicos para investigações.
Uma cultura primária de neurónios é essencialmente uma forma de cultura 2D e não representa a plasticidade, a integridade espacial ou a heterogeneidade do cérebro. Isso tem dado origem à necessidade de um modelo 3D mais crível chamado neuroesferas11,12. As neuroesferas apresentam uma nova plataforma para os neurocientistas, com uma semelhança mais estreita com o cérebro real, in vivo13. As neuroesferas são aglomerados 3D não aderentes de células que são ricas em células-tronco neurais (NSCs), células progenitoras neurais (NPCs), neurônios e astrócitos. Eles são uma excelente fonte para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras neurais, que podem ser usadas para estudar a diferenciação em várias linhagens neuronais e não-neuronais. Outra vez, a variabilidade dentro das culturas da neurofera produzidas usando os protocolos previamente relatados apresenta uma barreira à formulação de um protocolo unificado da cultura da neurofera14.
Este manuscrito apresenta um protocolo em que é possível gerar ambas as plataformas 2D e 3D alternando densidades do chapeamento de pilha de uma cultura cortical e hippocampal misturada. Observa-se que dentro de 7 dias as neuroesferas livres-flutuantes são obtidas dos neurônios chapeados high-density isolados do embrião do rato de E14-E16 Sprague Dawley, que em cima da cultura mais adicional, formam pontes e interconexões através das extensões glial-como radiais. Similarmente, nos neurônios chapeados da baixa densidade, uma cultura preliminar do neurônio que possa ser mantida por até 30 dias é obtida mudando o meio da manutenção duas vezes por a semana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de ética animal institucional do CSIR-Instituto indiano de biologia química (IICB/AEC/reunião/abr/2018/1).
1. reagente e preparação dos meios
- Solução de poli-D-lisina (PDL): Preparar soluções PDL em concentrações de 0,1 mg/mL em água desionizada e armazenar em 4 ° c até o uso.
- Meio de dissociação: para 1 L de água desionizada estéril e filtrada, combine os seguintes componentes nas respectivas concentrações: cloreto de sódio (8 mg/mL), cloreto de potássio (0,4 mg/mL), fosfato de potássio monobásico (0, 6 mg/mL), D-glucose (1 mg/mL), fosfato de sódio dibásico (0,479 mg/mL) e 1 M de HEPES [4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazineetanoesulfonic Acid; 10 mM]. Vortex todos os componentes para ajudar a mistura adequada e armazenar em 4 ° c até o uso.
Nota: Use o meio de dissociação em forma de gelo-frio durante a dissociação, mas à temperatura ambiente (RT) para lavagem e outros fins. - Meio do chapeamento: o meio do chapeamento consiste no seguinte: meio essencial mínimo (MEM) águia com solução de sal equilibrada de Earle (BSS; 88,4%), D-glicose (0,6%), soro do cavalo (10%), e penicilina/Streptomycin (1%). Combine os componentes nas respectivas proporções e realize o procedimento dentro de um capô condições estéreis.
Nota: Utilize sempre o meio de revestimento preparado recentemente para evitar a degradação de qualquer componente. - Meio de manutenção: Prepare o meio de manutenção combinando o seguinte nas respectivas proporções: meio neurobasal (97%), 0,5 mM amostra de glutamina comercialmente obtida, B27 suplemento livre de soro (2%) e penicilina/estreptomicina (1%). Combine os componentes nas respectivas proporções e realize o procedimento dentro de um capô condições estéreis. Assegure-se de que todos os componentes estejam preparados recentemente.
2. preparação de coberturas
- Pegue uma lamínula redonda de 12 mm de diâmetro e mergulhe-a em 1 M de ácido clorídrico (HCl) por 4 h.
- Transfira os COVERSLIP na água destilada usando um par de fórceps e gire-o delicadamente para começ livrado do ácido completamente.
- Transfira as coberturas lavadas para uma rodada adicional de limpeza em um copo contendo 100% de etanol.
- Antes de usar os lamínulas, seque-os bem na capa laminar, mantendo-os em papel tissue.
3. preparação de placas revestidas de poli-D-lisina para a cultura do neurônio
- Tome 2 24 placas do poço: uma para o chapeamento de alta densidade e outra para o chapeamento da baixa densidade. Abra os pacotes estéreis somente dentro da capa laminar.
- Transfira os 12 milímetros de coberturas de vidro estéreis nas 24 placas do poço.
- Despeje 300 μL de solução de PDL (0,1 mg/mL em água desionizada) em cada poço de modo que cubra totalmente a superfície das coberturas.
- Enrole as placas com folha de alumínio para evitar a secagem e mantê-lo na incubadora CO2 durante a noite.
- No dia seguinte (antes do chapeamento), aspirar a solução PDL e lavar adequadamente com 300 μL de água desionizada estéril duas a três vezes.
- Adicionar 200 μL de meio de revestimento recém-preparado e devolver as placas à incubadora até ao revestimento.
4. remoção e decapitação do feto
Nota: esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos embalados em folha de alumínio em autoclave a 121 ° c (15 psi) por 30 min. Isto inclui um par de tesouras Blunt-end, fórceps, fórceps fino, duas tesouras finas, e um fórceps da artéria para o procedimento inteiro.
- Para gerar neurônios e neuroesferas, use um rato Sprague Dawley cronometrado-grávido e marque o dia com a deteção vaginal do plugue como E0.
Nota: a cultura deve ser realizada entre E14-E16. - No dia da cultura, coloque uma placa de Petri de vidro estéril no gelo e encha-a com a solução fria de sal equilibrada de Hank (HBSS).
- Anestesiam um rato grávida E14-E16 com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de 90 mg de cetamina/kg de peso corporal e 10 mg de xilazina/kg, depois sacrificam-se realizando luxação cervical.
Nota: os ratos também podem ser eutanasiados por uma overdose de pentobarbital ou overdose de cetamina com xilazina ou diazepam. - Esterilize o abdômen da represa pulverizando o etanol de 70% e faça um corte em forma de V na área abdominal usando o fórceps estéril e um par de tesouras Blunt-end.
- Tome os sacos embrionários com cuidado na placa de Petri com a solução fria de HBSS.
Nota: não use o mesmo fórceps e tesouras que foram usados apenas para a pele, como isso irá contaminar os órgãos internos. Use um conjunto diferente de tesouras/fórceps para os órgãos internos. - Leve os embriões para fora dos sacos embrionários em HBSS fresco e frio.
- Decapitar a cabeça com uma tesoura estéril.
5. remoção do cérebro e dissecção do córtex com hipocampo
- Antes de começar, encha 90 mm de placas de Petri estéreis com HBSS frios e estéreis.
- Transfira as cabeças nos pratos estéreis usando o fórceps estéril, Blunt-terminado do curativo.
- o estereomicroscópio, segure a cabeça da região de focas com fórceps estéril, serrilhada e remova o cérebro cortando a pele e o crânio abertos.
- Colete todos os cérebros de embriões da mesma maneira na solução HBSS.
- Remova todas as meninges dos hemisférios e do midbrain segurando o tronco cerebral.
- Remova com cuidado os hemisférios intactos que lembram os tampões do cogumelo que contêm o hipocampo e o córtice.
- Colete os hemisférios contendo córtex e hipocampo intacto em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de meio de dissociação.
6. dissociação do tecido cortical e hipocampal em neurônios únicos
- Permitir que os tecidos recolhidos para acalmar e aspirar o meio de dissociação, deixando 5%-10% do meio nele.
- Adicione 10 mL de meio de dissociação fresca ao tecido e repita o passo 6,1 duas vezes.
- Adicionar 4,5 mL de meio de dissociação e 0,5 mL de 0,25% (1x) tripsina EDTA (etileno diamina tetraacetato) solução.
- Mantenha o tecido na incubadora a 37 ° c por 20 min para que a digestão prossiga.
- Aspirar o meio e adicionar 10 mL de dissociação e chapeamento médio consecutivamente aos tecidos digeridos.
- Permitir que os tecidos digeridos para acalmar e aspirar o meio de dissociação. Adicione 2,5 mL de meio de chapeamento e despeje na base de um prato estéril de 90 mm.
- Triturar os tecidos digeridos na base de canto do prato usando uma ponta de pipeta 1.000 μL para ocupar o volume mínimo.
- Passar a suspensão celular obtida através do filtro de células de 70 μm, excluindo quaisquer pedaços de tecido.
- Determine a densidade de células viáveis usando o método de exclusão de corante azul de Tripan e conte o número de células em um contador de célula automatizado.
- Para o método de exclusão de corante azul de Tripan, tome 10 μL da suspensão celular e 10 μL de 0,4% de mancha azul de Tripan, misture bem e adicione 10 μL da mistura em uma das duas câmaras fechadas das lâminas de câmara descartáveis.
- Insira o slide que contém a mistura no contador de células e obtenha a leitura.
Nota: o método de exclusão de corante azul Tripan baseia-se no princípio de que as células ao vivo (devido às suas membranas intactas) excluirão o corante azul de Tripan e, portanto, mostrarão um citoplasma claro, comparado a uma célula não viável que facilmente levará o azul de Tripan e aparecerá em azul cor15.
- Diluir o número de células obtidas para a placa 1,5 x 105 células/ml para alta densidade e 20.000 células/ml para baixa densidade em dois tubos separados contendo 30 ml cada um do meio de chapeamento.
- Aspirar o meio de chapeamento previamente adicionado de cada poço e placa 500 μL de células dispersas em meio de chapeamento em cada poço.
- Depois que retorne as placas à incubadora em 37 ° c e a 5% CO2 para 4 h.
- Examine as células para a aderência o microscópio 4 h após o chapeamento.
- Se houver aderência adequada das células em ambas as placas, substitua o meio em cada poço com 500 μL de meio de manutenção fresca e incubar a 37 ° c.
- Cultura estes neurônios cultivados em baixa densidade por 30 dias, alterando o meio de manutenção 2x por semana.
- Cultura as neuroesferas obtidas a partir dos neurônios chapeados de alta densidade no mesmo meio de manutenção, transferindo-os para as placas de fixação Ultrabaixa.
- Caracterizar os neurônios e as neuroesferas por imunocoloração-los com marcadores importantes. Para Immunocytochemistry, primeiramente fixe as pilhas/neurospheres usando o formaldehyde de 4% por 30 minutos na placa própria, a seguir permeabilize as pilhas com o detergente non-ionic de 0,1% por 10 minutos.
- Adicione anticorpos primários para ambos os neurônios (anti-Tuj1, GFAP, O4, Tau) e neuroesferas (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) em 1:300 concentrações e incubar durante a noite a 4 ° c16.
Nota: o Tuj1 (classe III β-tubulin) e Tau são marcadores positivos para os neurônios primários, enquanto GFAP (proteína glial fibrilhar ácida) e O4 (marcador oligodendrocyte) são marcadores negativos para os neurônios primários17,18. No caso das neuroesferas, Tuj1, GFAP e Nestin servem como marcadores positivos19,20. - No dia seguinte, lave as células com PBS uma ou duas vezes e adicione anticorpos secundários apropriados em PBS a 1:600 concentrações em RT por 2 h.
Observação: os anticorpos secundários anti-mouse ou anti-Rabbit são selecionados dependendo da espécie hospedeira do anticorpo primário adicionado. Deve ser mantido na mente que os anticorpos secundários devem ser conjugados aos derivados da fluorescência apropriados para finalidades da microscopia de fluorescência. - Lave as células novamente com PBS uma ou duas vezes.
- Realize a coloração nuclear das células com Hoechst 33258 (1 mg/mL de solução em água desionizada). Prepare 0,1% solução Hoechst em PBS a partir da solução de ações e adicioná-lo às células.
- Incubar as células com 0,1% solução de Hoechst por 30 min, em seguida, lave novamente com PBS.
- Adicionar 20 μL de PBS (ou meio de montagem) no slide e montar lentamente a lamínula contendo as células manchadas sobre a área do slide contendo PBS. Selar as margens da lamínula com xileno de poliestireno de Dibutilftalato (DPX).
- Realize imagens das células fixas um microscópio a uma ampliação de 10x e 40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste protocolo, uma estratégia simples foi elucidada em que as densidades variáveis do chapeamento de pilha de duas plataformas de seleção neural diferentes são obtidas. A Figura 1a,B ilustra a aderência das células após 4 h de chapeamento dos neurônios em células de alta e baixa densidade, respectivamente. Ao observar a aderência adequada dos neurônios como mostrado na Figura 1, o meio de revestimento foi substituído por meio de manutenção em cada um dos poços e, assim, retornou à incubadora a 37 ° c. Comparativamente mais adesão da pilha foi observada nos neurônios chapeados high-density. Após 24 h de chapeamento, os neurônios chapeados de alta e baixa densidade mostraram extensões neuronais elaboradas e interconexões sinápticas, como observado nas imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) na Figura 2a,B.
Na Figura 3a, uma imagem de contraste de fase dos neurônios chapeados de baixa densidade após 7 dias na cultura é representada. Aqui, os neurônios desenvolveram uma rede sináptica elaborada consistindo de ramos dendríticos. Estes neurônios podem ser mantidos por até 30 dias mudando o meio de manutenção a cada 3 dias com o desenvolvimento de redes neuronais mais intrincadas. Na Figura 3B,C, a coloração Immunocytochemical foi realizada para revelar a natureza neuronal de neurônios de cultura de baixa densidade por coloração com marcadores neuronais Tuj1 (um marcador de neurônios diferenciados)21 e Tau (um marcador de axônios)22 , respetivamente. A cor vermelha na Figura 3B indica a presença de coloração Tuj1, e o verde na Figura 3C representa a coloração nos axônios dos neurônios primários. A pureza da cultura neuronal é mostrada pela ausência de coloração de marcadores não-neuronais para GFAP de astrócitos (Figura 3D) e O4 de oligodendrócitos (Figura 3E). Os núcleos mostrados no azul foram manchados com Hoechst 33258.
Os neurônios chapeados de alta densidade após 7 dias são marcados pela formação de neuroesferas espontâneas, como observado na figura 4a,B,C,D. Após 8-10 dias, foram observadas pontes distintas que consistiam de extensões radiais de glial entre as neuroesferas, como observado na Figura 4E. As neuroesferas foram ricamente dotadas de NPCs, que coexpressam os marcadores Nestin e Tuj123. As neurospeheres mostram coloração positiva de Nestin e Tuj, como mostrado na Figura 524. Os núcleos mostrados no azul foram manchados com Hoechst 33258. Estas neuroesferas podem ser mantidas por várias semanas, cultivando-as em placas de fixação Ultrabaixa. Na Figura 6, foi avaliada a longevidade dos neurônios cultivados por cerca de 30 dias, e a viabilidade celular foi mensurada em um intervalo de ~ 5 dias usando o ensaio convencional de MTT [3-(4, 5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio], no qual foi constatou que os neurônios apresentaram mais de 90% de viabilidade mesmo após 30 dias de cultura.
Em seguida, avaliou-se a percentagem de astrócitos nas culturas semeadas de alta e baixa densidade. Uma vez que esta metodologia é voltada principalmente para a cultura de neurônios, foi importante avaliar se este método suporta o crescimento preferencial de neurônios sobre células não-neuronais, especialmente os astrócitos. A presença de uma população de astrócitos foi observada na cultura de alta densidade de formação de neurofera, marcada pela coloração verde da GFAP na Figura 7a; embora, significativamente menos foi observado comparado ao Tuj1 (vermelho)-população neuronal manchada. Isso também foi reafirmado pelos dados quantitativos da Figura 7B, em que ~ 17% das populações de células foram expressando GFAP, em comparação com 83% da população em Tuj1 expressando células.
A população astrocítica também foi investigada por meio da coloração de GFAP, comparada à população neuronal (coloração Tuj1) em células semeadas de baixa densidade, durante 7 dias contínuos. Embora uma diferença significativa no número total de células não tenha sido observada durante o curso de 7 dias, devido à baixa semeadura, a população de astrocícitos também foi observada como sendo muito baixa (quase nenhuma ou muito baixa coloração de GFAP), sendo a maioria a população neuronal (muito expressão Tuj1 elevada), como observado na figura 8a.
Como mostrado na Figura 8B, a análise quantitativa foi realizada contando-se a população de astrócitos e neurônios obtidos através da microscopia com o auxílio do software cellsens, no qual apenas ~ 2%-3% da população de astrocite foi observada inicialmente. Devido à falta de meios adequados e nutrientes para apoiar o seu crescimento, esta população de astrócitos também lentamente pereceram ao longo do tempo, enquanto que na presença de fatores ideais e meios de comunicação, os neurônios rapidamente assumiu toda a cultura.
Como mostrado na Figura 9, observou-se que, devido à presença de NPCs, as neuroesferas também expressaram altas quantidades de astrócitos, marcadas pelo forte sinal verde da coloração de GFAP, juntamente com um sinal Tuj1 mais forte. Finalmente, para observar se essas neuroesferas se expandiram ao longo do tempo, após 1 semana de cultura de alta densidade, altura em que as pequenas neuroesferas começaram a se formar, algumas foram transferidas em placas de fixação Ultrabaixa e seu crescimento foi monitorado a cada 5 dias para até 15 dias.
Um ensaio de células mortas/vivos também foi realizado com calceina AM (verde) e iodeto de propiídio (vermelho) para verificar a saúde das células. Observou-se que as neuroesferas em expansão mostraram grande quantidade de fluorescência verde sem coloração vermelha, indicando que não ocorreram mortes nas neuroesferas por pelo menos 15 dias de cultura, conforme apresentado na Figura 10A. Como mostrado na Figura 10B, a expansão volumosa das neuroesferas foi observada a cada 5 dias em cultura por até 15 dias. Para traçar o gráfico de linha representando o eventual aumento do volume de neuroesferas (para cada ponto temporal), foram estudadas 50 neuroesferas, e suas médias foram utilizadas para derivar os volumes da neurofera em cada ponto temporal.
Figura 1 : Respresentação da adesão da pilha após 4 h do chapeamento. (A) adesão celular em neurônios chapeados de alta densidade. (B) adesão celular em neurônios chapeados de baixa densidade. A barra de escala em (A, B) é 200 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Morfologia da pilha dos neurônios após 24 h do chapeamento. (A) morfologia celular dos neurônios chapeados de alta densidade. (B) morfologia celular de neurônios chapeados de baixa densidade. As barras de escala em (A, B) representam 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Morfologia e caracterização de neurônios chapeados de baixa densidade após 7 dias. (A) fase-imagem do contraste dos neurônios que mostram sprouting extensivo. A barra de escala representa 200 μm. sobreposição de imagens mostrando a expressão de proteínas neuronais (B) Tuj1 (vermelho) e (C) Tau (verde). Immnunocytochemistry claramente mostrando ausência de coloração em proteínas não-neuronais (D) GFAP (verde) e (e) O4 (vermelho). Os núcleos foram manchados com Hoechst 33258 (azul). As barras de escala em (B, C, D, E) representam 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Formação de neuroesferas em neurônios chapeados de alta densidade após 7 dias. (A-D) Neuroesferas espontâneamente geradas após 7 dias na cultura dos neurônios chapeados high-density. (E) formação de extensões radial glial-like entre duas neuroesferas recém-formadas como indicado por setas pretas. As barras de escala em (A, B, C, D, E) representam 200 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Caracterização das neuroesferas obtidas. Imagem da sobreposição das neuroesferas que mostram a expressão para a proteína neuronal Tuj1 (vermelho) e o marcador neural da pilha de haste Nestin (verde), indicando uma população NPC-rica. Os núcleos foram manchados com Hoechst 33258 (azul). A barra de escala representa 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Viabilidade celular de neurônios primários. O gráfico de barras representa a viabilidade celular dos neurônios primários, avaliados por meio de um ensaio de MTT por até 30 dias em intervalos de 5 dias. A barra de erro representa o SD do valor (* p < 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Caracterização de culturas high-density da neurosphere-formação com marcador neuronal Tuj1 e marcador GFAP do astrocyte. (A) aimagem mostra células semeadas de alta densidade (no modo DIC), que gera neuropsheres expressando tanto GFAP (para astrócitos) e Tuj1 (para neurônios). Os núcleos foram manchados com Hoechst 33258. A barra de escala representa 20 μm. (B) gráfico de barras representa o percentual da população de células expressando Tuj1 e células expressando GFAP na neuroesfera gerando células de alta densidade. Barra de erro representa SD (* p < 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Caracterização de pilhas chapeadas de baixa densidade para a cultura preliminar do neurônio com marcador neuronal Tuj1 e marcador GFAP do astrocyte continuamente até 7 dias. (A) aimagem mostra as células semeadas de baixa densidade em quatro canais diferentes (ou seja, DIC, canal azul [indica coloração nuclear por Hoechst 33258], canal verde [coloração GFAP] e canal vermelho [para coloração Tuj1]) por 7 dias continuamente. A barra de escala representa 20 μm. (B) o gráfico de barras representa a proporção percentual de populações de células expressando Tuj1 às células que expressam GFAP nas células semeadas de baixa densidade para a cultura do neurônio primário por 7 dias. Barra de erro representa SD (* p < 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Imunocoloração de neuroesferas obtidas com GFAP e Tuj1. As imagens das neuroesferas obtidas são (a) em modo DIC, (B) coloração do núcleo usando Hoechst 33258, (C) marcador de astrocite GFAP (verde) e (D) marcador neuronal Tuj1 (vermelho). A barra de escala representa 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 : Crescimento e ensaio de células mortas e vivos de neuroesferas ao longo de 15 dias. (A) a imagem mostra o crescimento de uma neurofera ao longo de 15 dias em intervalos de 5-dia no modo DIC, bem como a sua coloração com calceina am (verde indica células ao vivo) e PI (iodeto de propiídio com uma cor vermelha indica células mortas). A barra de escala representa 20 μm. (B) gráfico representa o aumento do tamanho das neuroesferas cultivadas em placas de baixa aderência ao longo de um período de 15 dias em intervalos de 5 dia. A barra de erro representa o SD. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo descreve que como alterando as densidades do chapeamento de pilha de neurônios preliminares, duas plataformas neuronal variáveis são obtidas. Embora este seja um método simples, cada etapa deve ser meticulosamente realizada para alcançar os resultados desejados. Outros métodos anteriores relataram culturas de neurônio primários de longo prazo ou culturas de neurofera. A maioria de protocolos preliminares da cultura do neurônio envolveram o cultivo de neurônios hippocampal por 3-5 semanas, mas a maioria falharam, porque os neurônios morrem e murcham afastado devido à perda de conexões. Outra vantagem do protocolo é que os neurônios podem ser cultivados sem a necessidade de qualquer camada de alimentador glial, portanto, manter a pureza dos neurônios.
No entanto, várias etapas críticas devem ser seguidas cuidadosamente para obter os resultados desejados. Em primeiro lugar, a manutenção de condições estéreis é absolutamente necessária. Recomenda-se executar a maioria de etapas em uma capa laminar assim como pre-clean todas as lajes, instrumentos, e ferramentas cirúrgicas com álcool de 70% antes de começar; caso contrário, há uma maior chance de falha devido à contaminação por bactérias e fungos. Em seguida, é importante isolar os embriões E14-16; daqui, a etapa vaginal da deteção do plugue deve com cuidado ser executada. À medida que o dia embrionário aumenta, quanto maior as chances são de contaminação por células não-neuronais. A remoção completa de meninges dos hemisférios é extremamente crítica para reduzir a interferência na cultura por células não-neuronais. O meio do chapeamento e da manutenção deve recentemente ser preparado com todos os componentes, porque cada componente joga um papel essencial. Outro fator que deve ser mantido em mente é que os neurônios primários obtidos devem ser mantidos mudando o meio de manutenção 2x por semana para que o suprimento de nutrientes para os neurônios proliferantes permaneça constante.
Embora não tenha sido tentado ainda, este protocolo com modificações ligeiras pode igualmente ser útil em neurônios embrionário do rato. Se os neurônios ou neuroesferas desejados não forem obtidos seguindo esta técnica, há algumas dicas de solução de problemas que podem ser úteis. Para manter os tecidos viáveis, a dissecção deve ser realizada em HBSS gelada. A dissecção também pode ser realizada no gelo-Cold Krebs buffer em vez de HBSS buffer. A realização rápida da dissecção é fundamental para manter a viabilidade tecidual. O uso da tripsina 10x levará à superdigestão do tecido. Daqui, a solução do trypsin-EDTA 10x deve ser diluída a 1x no amortecedor da dissociação antes da digestão. A adição de meio gelado às células, induzindo o congelamento-choque, deve ser evitada a todo o custo, e médio depois de atingir RT deve ser usado em seu lugar. Mais importante ainda, as coberturas devem sempre ser revestidas com PDL, caso contrário, os neurônios não vai anexar a lamelas. Em caso de alguma dificuldade ao executar a etapa da trituração (isto é, o tecido que não digerem corretamente), a digestão pode ser executada adicionando 0,5 mL de DNase de 1% por 10 minutos. Se forem encontrados altos graus de contaminação por células não neuronais, deve-se adicionar ~ 5 μM de citosina arabinosídeo (araC) para evitar o crescimento de células não neuronais.
Apesar de suas múltiplas vantagens, esta técnica sofre de algumas limitações. Sabe-se que essa técnica gera espontaneamente neuroesferas (embora os mecanismos moleculares desencadeantes não sejam conhecidos); no entanto, permanecem poucas ambiguidades em relação a essa técnica, como o tamanho exato das neuroesferas formadas e o número exato de dias necessários para formar um número suficiente de neuroesferas. Principalmente, o tamanho é o problema. Embora tenha sido observado que as neuroesferas se expandem em volume ao longo do tempo, as neuroesferas iniciais obtidas são de tamanhos variáveis. Embora útil, torna-se difícil realizar um estudo sincronizado. O que distingue este protocolo de geração de partir dos outros é a sua robustez e simplicidade. Há uns protocolos relatados mais adiantados para o cultivo e a propagação dos neuropheres que exigem exigências médias especiais e condições da cultura, nenhuma de que é exigida neste protocolo. Nestes protocolos previamente relatados, há quase nenhuma uniformidade para aqueles que olham para gerar neurospheres.
Globalmente, este protocolo descreve uma estratégia única para a geração de plataformas neuronais 2D e 3D simplesmente alterando as densidades de chapeamento de células de neurônios primários isolados de embriões de ratos E14-E16 Sprague Dawley. Este método é rentável em comparação com outros métodos, como ele pode ser realizado com uma simples set-up e requer muito menos reagentes e etapas. Ele pode fornecer várias aplicações de interesse para os neurocientistas. Isso pode ser usado como plataformas de triagem para várias ligações neuro-terapêuticas, observando os papéis de várias proteínas de carga neuronal, investigações de vias celulares em muitas doenças neurodegenerativas, e muitas outras aplicações. As neuroesferas podem ser mais utilizadas para a triagem de vários agentes diferenciadores neurais e estudar os estágios iniciais do desenvolvimento neural in vitro25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a instalação animal da CSIR-IICB. G. D. graças ICMR, J. K. e V. G. agradecer DST Inspire, e D. M. obrigado DBT, Índia para suas bolsas. S. G. gentilmente reconhece SERB (EMR/2015/002230) Índia para fornecer apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G.
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
