Summary
שיטת לוקליזציה vivo immunofluorescence ניתן להשתמש כדי לבחון ב vivo biodistribution של נוגדנים ושערי מעלה נוגדן למטרות אונולוגיות באורגניזמים חיים באמצעות שילוב של vivo הגידול מיקוד ולשעבר vivo חיסוני שיטות.
Abstract
נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) הם כלים חשובים בזיהוי סרטן, אבחון וטיפול. הם משמשים כדי לפענח את התפקיד של חלבונים בטווריגנזה, ניתן להפנות בסמנים סרטניים המאפשרים איתור ואפיון הגידול, והוא יכול לשמש לטיפול בסרטן כמו mAbs או נוגדן תרופות המעלה להפעיל את התאים החיסונית החיסון, כדי לעכב איתות מסלולים, או ישירות להרוג תאים הנושאים את האנטיגן המסוים. למרות החידושים הקליניים בפיתוח וייצור של הרומן מאוד ספציפי mAbs, אבחון ויישומים טיפולית יכול להיות לקוי על ידי המורכבות והטרוגניות של מיקרוסביבה הגידול. כך, לפיתוח של טיפולים יעילים נוגדן מבוססי ודיאגנוסטיקה, זה חיוני כדי להעריך את ההתפלגות הביומלית ואינטראקציה של המשלים מבוסס נוגדן עם מיקרוסביבה הגידול החיים. כאן, אנו מתארים ב Vivo Immunofluorescence לוקליזציה (IVIL) כגישה חדשה ללמוד אינטראקציות של therapeutics מבוססי נוגדן ואבחון בתנאים פיסיולוגיים Vivo ופתולוגיים. בטכניקה זו, נוגדן טיפולי או אבחון ספציפי של אנטיגן הוא מוזרק באופן מvivo ומקומי לשעבר vivo עם נוגדן משני בגידולים מבודדים. לכן, לפיכך, משקף את vivo biodistribution של תרופות מבוססות נוגדן וסוכני מיקוד. שני יישומים IVIL מתוארים הערכת ביוהפצה ונגישות של סוכני ניגודיות מבוססי נוגדן עבור דימות מולקולרי של סרטן השד. פרוטוקול זה יאפשר למשתמשים עתידיים להתאים את שיטת ה-IVIL עבור יישומי מחקר מבוססי נוגדן שלהם.
Introduction
נוגדנים חד-שבטיים (mAb) הם גליקורופנים גדולים (כ 150 kDa) של משפחת האימונוגלובולין המופרש על ידי תאי B ויש להם תפקיד עיקרי במערכת החיסונית כדי לזהות ולעכב את הפונקציה הביולוגית של, או לסמן עבור הרס, חיידקי או נגיפי פתוגנים, והוא יכול לזהות ביטוי חלבון חריג על תאים סרטניים1. נוגדנים יכולים להיות אהדה גבוהה מאוד האפיסקופים הספציפיים שלהם למטה בריכוזים של הנשים הללו הופכים אותם כלים מבטיחים ביותר ביודיקטנין2. עם פיתוח הטכנולוגיה היפידים על ידי מילשטיין ו Köהלר (הוענק פרס נובל ב 1984), הייצור של mAbs הפכה אפשרית3. מאוחר יותר, mabs האדם נוצרו באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage או זנים העכבר הטרנסגניים מהפכה שלהם לשימוש ככלי מחקר הרומן therapeutics4,5.
סרטן הוא נושא בריאות ברחבי העולם והגורם העיקרי של המוות יצירת הצורך גישות הרומן למניעת, זיהוי, וטיפול6. עד כה, mAbs אפשרו extrication של התפקיד של גנים והחלבונים שלהם בטומגנזה וכאשר מכוונים נגד בדיקות סרטן, יכול לאפשר זיהוי גידולים ואפיון עבור המטופל ריבוד. עבור טיפול בסרטן, mAbs מיוחד, נוגדן סמים שערי מעלה, ושברי נוגדנים קטנים מפותחים כמו therapeutics, ועל מסירת התרופה ממוקד כדי לשפר את היעילות הטיפולית7. בנוסף, נוגדנים לשרת מיקוד הסמנים של סוכני ניגודיות עבור הדמיה מולקולרית שיטות כגון כירורגיה פלואורסצנטית מונחה, פוטואקוסטית (PA) הדמיה, אולטרסאונד (ארה ב) הדמיה מולקולרית, ו קלינית פליטת פוזיטרון טומוגרפיה ממוחשבת (PET) או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון (מחשב)8. לבסוף, נוגדנים יכולים לשמש גם כסוכני theranostic המאפשרים ריבוד של חולים וניטור תגובה עבור טיפולים ייעודיים9. לכן, mAbs הרומן מתחילים לשחק תפקיד קריטי באיתור סרטן, אבחון, וטיפול.
למרות החידושים הקריטיים בפיתוח וייצור של הרומן מאוד ספציפי mAbs, אבחון ויישומים טיפולית יכול להיות מעובד בלתי יעיל בשל המורכבות של סביבת הגידול. אינטראקציות הנוגדן תלויות על סוג האפירופה, כלומר, בין אםהוא ליניאריאו בקונפורמציה10. בנוסף להכרה של אנטיגנים, נוגדנים צריכים להתגבר על מחסומים טבעיים כגון קירות כלי, קרום בסיס, ואת משתית הגידול כדי להגיע לתאי היעד לבטא את האנטיגן. נוגדנים לקיים אינטראקציה עם הרקמה לא רק באמצעות משתנה כריכה אנטיגן המקטע (Fab) התחום אלא גם דרך השבר הגבישי הקבוע (Fc) אשר מוביל עוד יותר מחוץ לאתר אינטראקציות11. המיקוד הוא גם מסובך על ידי הביטוי הטרוגנית של סמנים הגידול לאורך הגידול בצובר וטרוגניות בגידול vascularization ומערכת lymphatics12,13. בנוסף, מיקרוסביבה הגידול מורכב סרטן הקשורים פיברותקיעות אשר תומכים בתאי הגידול, הגידול תאים חיסוניים לדכא את התגובות החיסונית נגד הגידול, ואת אנדותל הגידול התומך הובלה של חמצן וחומרים מזינים, כל אשר מפריעים לחדירה, להפצה ולזמינות של therapeutics או אבחון מבוססי נוגדן. בסך הכל, שיקולים אלה יכולים להגביל את היעילות הטיפולית או אבחון, להפחית את תגובת הטיפול, ועלול לגרום להתנגדות לגידול.
לכן, לפיתוח של טיפולים יעילים נוגדן מבוססי ודיאגנוסטיקה, זה חיוני כדי להעריך את ההתפלגות הביומלית ואינטראקציה של המשלים מבוססי נוגדן בתוך מיקרוסביבה הגידול. כיום, במחקרים פרה-קליניים, ביטוי סמן מודלים מחקר הגידול מנותח ex vivo על ידי immunofluorescence (IF) כתמים של סעיפים הגידול14. תקן IF כתמים מבוצע עם נוגדנים ספציפיים סמן העיקרי אשר מודגשים אז על ידי נוגדנים משני התווית על הרקמה לשעבר vivo רקמות הגידול שהיו מבודדים מהחיה. טכניקה זו מדגיש את המיקום הסטטי של הסמן בזמן קיבוע רקמות אינו מספק תובנה כיצד therapeutics מבוסס נוגדן או אבחון עשוי להפיץ או אינטראקציה בתנאים פיזיולוגיים. הדמיה מולקולרית על ידי PET, הזהיר, ארה ב, ו-PA יכול לספק מידע על התפלגות נוגדן הסוכן בניגוד מצומדת בחיים מודלים פרה8,15. כמו אלה שיטות הדמיה הם לא פולשנית, מחקרים האורך ניתן לבצע ונתונים רגישים לזמן ניתן לאסוף עם מספר מינימלי של בעלי חיים לכל קבוצה. עם זאת, אלה לא פולשני גישות הדמיה מולקולרית אינם רגישים מספיק אין להם מספיק החלטה לוקליזציה של התפלגות נוגדן ברמה התאית. בנוסף, המאפיינים הפיזיים והביולוגיים של הנוגדן העיקרי עשויים להשתנות באופן דרסטי על ידי הקוניוגציה של סוכן ניגודיות16.
על מנת לקחת את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים vivo בהתחשב באופן הפעולה המבוסס על נוגדנים therapeutics ואבחון בתוך סביבת הגידול ולהשיג התפלגות תאית ברזולוציה גבוהה ואפילו תת-תאית פרופילים של נוגדנים שאינם מצוהרים, אנו מציעים גישה IF, הנחשבים לוקליזציה Vivo Immunofluorescence (IVIL), שבו הנוגדן הספציפי אנטיגן מוזרק באופן מידי בVivo. נוגדן מבוססי טיפול או אבחון, מתנהג כנוגדן העיקרי, מסתובב כלי דם פונקציונלי נקשר החלבון היעד שלה בסביבת הגידול מדויק מאוד, חיים בסביבה. לאחר בידוד של גידולים vivo עם הנוגדן העיקרי, נוגדן משני משמש לוקליזציה מצטבר ונשמר שערים נוגדן. גישה זו דומה לזו שתוארה בעבר אם גישה היסטולוגיה הזרקת נוגדנים מתויג באופן שכותרתו17. למרות שכאן, השימוש בנוגדנים שאינם מצופנים מונע שינוי פוטנציאלי במאפייני ההתפלגות הביומלית הנגרמת על ידי שינוי נוגדנים. יתר על כן, היישום vivo ex של נוגדן משני פלורסנט מונע אובדן אפשרי של אות פלואורסצנטית במהלך איסוף רקמות ועיבוד ומספק הגברה של עוצמת אות פלואורסצנטית. הגישה שלנו תיוג משקף vivo biodistribution של תרופות מבוססות נוגדן סוכנים ייעודיים והוא יכול לספק תובנות חשובות לפיתוח של סוכני אבחון וריפוי הרומן.
כאן, אנו מתארים שני יישומים של שיטת IVIL כפי שהוחלו במחקרים קודמים בחקירת ביוהפצה ונגישות של סוכני הניגודיות מבוססי נוגדן עבור גישות הדמיה מולקולרית לאיתור סרטן השד. ראשון, התפלגות biodistribution נוגדן-ליד צבע אינפרא אדום המשלים (anti-B7-H3 נוגדן מאוגד לצבוע בסמוך אינפרא אדום, indocyanine ירוק, B7-H3-ICG) ואת הסוכן בקרת isotype (Iso-ICG) עבור הקרינה הפלואורסצנטית ו-photoacoustic מולקולרית הדמיה מחקר18. שיטת יישום זו מתוארת בפרוטוקול. לאחר מכן, תוצאות ההתפלגות הביומלית של נוגדנים רגישים מבחינה מבצעית לנטרין -1, בדרך כלל לא לזיהוי עם הדמיה IF מסורתית, בשימוש עם דימות מולקולרי אולטרסאונד, הוא כימות והציג בתוצאות הנציג19. בסיום זה נייר פרוטוקול, הקוראים צריכים להרגיש בנוח לאמץ את שיטת ה-IVIL עבור יישומי מחקר מבוססי נוגדן שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הפאנל המינהלי המוסדי על טיפול בעלי חיים מעבדה (APLAC) של אוניברסיטת סטנפורד.
1. מודל העכבר הטרנסגניים של התפתחות סרטן השד
- להתבונן עכברים ממודל הסרטן הרצוי לצמיחת הגידול המתאים באמצעות מישוש או קליבר מדידה לפני שתמשיך.
הערה: כאן, המודל הטרנסגניים מורגנית של התפתחות סרטן השד (FVB/N-Tg (MMTV-PyMT) 634Mul ולטימול/J) (MMTV-PyMT) שימש. בעלי חיים אלה לפתח באופן ספונטני קרצינומה של השד פולשני בין 6 ו 12 שבועות של גיל בכל בלוטת החלב20. בלוטות החלב הרגילות שימשו כפקדים מן הטרנסגנים-שליליים, הגילאים התואמים התאומות.
2. הזרקה של גורמי נוגדן ספציפיים ולא ספציפיים
- לטהר את הארנב נגד עכבר B7-H3 ו ארנבת IgG שליטה נוגדנים על עמודה התפלה (g., PD-10) כדי להסיר חומרים משמרים ומאגרי אחסון בעקבות הוראות היצרן.
הערה: נוגדנים מסוימים עשויים להזדקק לטיהור נוסף עם חלבון-מחרוזת agarose מבוסס פרוטוקול21. - Aliquot המינונים של 33 μg של כל המשלים נוגדנים בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים.
הערה: המינון של הסוכן המנוהל עשוי להשתנות בהתאם ליישום ומתאים למינונים שבהם משתמש הנוגדן משמש באופן שגרתי. הריכוז של פתרונות הנוגדן נדרש אם אמצעי האחסון הוא יותר מ-100 μL עבור בטיחות בעלי חיים. - בזמן הרצוי לפני איסוף הרקמה, כאן 96 h, מורדם הגידול הנושאת את בעל החיים עם 2% isof, הזורם בחמצן ב 2 L/min, ומקום על 37 ° c בשלב מחומם. לעשות צביטה הבוהן כדי לוודא את הרמה הנכונה של anesthsia הגיע לפני ההליך.
- כדי להתכונן לווריד הזנב של פתרונות הנוגדן, לחטא את זנב החיה על ידי ניגוב שלוש פעמים עם מנגב אלכוהול. מתרחבים ורידי הזנב על ידי התחממות עם משטח חום של כ -30 ס מ. הימנע מחימום החיה כולה. לנגב את הזנב פעם נוספת עם מחיקת אלכוהול לאחר הסרת משטח החום.
- באמצעות קטטר וריד הזנב 27G, להכניס את המחט פרפר לתוך אחד שני ורידים הזנב לרוחב בזהירות לתקן את הזנב עם המחט שנוספה לבמה עם פיסת קלטת כירורגית.
הערה: זרימת הדם הנראית לעין לתוך הקטטר מציין את המיקום הנכון של המחט בתוך הווריד הזנב. - ריקון קטטר עם 25 μL של מלוחים סטרילי מתכלה באגירה (PBS), ואז להזריק את פתרון הנוגדן לתוך הקטטר באמצעות מזרקים אינסולין. רוקן את הקטטר שוב עם 25 μL של PBS סטרילי.
- להסיר את המחט מהזנב ולהפעיל לחץ כדי לעצור דימום.
- לכבות את ההרדמה ולהתבונן בחיה עד שתתעורר במלואו לכל סימן של מצוקה.
3. איסוף והכנת רקמות הגידול היעד
- בנקודת הזמן הרצויה, המתת הומאנית החיה על פי הנוהל המוסדי המקובל, כאן, על ידי שאיפת הדרגתית של 100% CO2 מ מיכל גז דחוס עם שיעור זרם העקירה הקאמרית של 10-30% אמצעי אחסון/דקה.
הערה: יישומים מסוימים של טכניקת ivil דורשים המתת חסד על ידי זלוף לב עם PBS כדי להסיר את הנוגדן במחזור חופשי19,22. - לאחר אישור של המתת חסד הומאני באמצעות הפסקת תנועת הנשימה והלב, חוסר התגובה צביטה הבוהן, ומאפיר של קרום רירי, רקמות גידול בלו באמצעות מספריים כירורגי מלקחיים כדלקמן:
- הנח את העכבר בתנוחה פרקדן ואוחז רק את השכבה החיצונית של העור בין הקבוצה של בלוטות החלב הקרובה ביותר לזנב (5ה) עם מלקחיים, לעשות חתך קטן עם זוג של מספריים כירורגית.
- הציגו את המספריים הסגורות בתוך החתך ופתחו באיטיות את הקצה כדי להפריד בזהירות את העור מקרום הבטן המשמש כבסיס לשמירה על שלמות.
- ליצור חתך אנכי בבטן, המשך להפריד את העור מן הקרום הפנימי. בין בלוטות החלב3 ו -4 , לעשות חתך אופקי על פני הבטן כדי לאפשר נסיגה של העור והדמיה של בלוטותהחלב.
הערה: גידולים ובלוטות הפטמות ממוקמים בשטחי מתחת לעור. - אוחז כל גידול או בלוטה נורמלית עם מלקחיים, לקצץ בזהירות את העור המצורפת באמצעות מספריים כירורגי.
- מניחים רקמות מחעלות לתוך בסיס לרקמות חד פעמיות, מסומנים ומלאים בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) הטבעה בינונית והקפאת התבניות במהירות על-ידי הצבת על קרח יבש. כדי ללמוד את מסירת היעד, בבלו רקמות אחרות או איברי עניין (למשל,הכבד או הריאות).
הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, אחסן בלוקים של רקמות קפואות ב-80 ° צ' עד שמוכן להמשיך. - באמצעות קריוסטט, מקטע בלוקים רקמות קפואות ב 10 יקרומטר עובי ומקום מקטעים סמוכים על שקופיות הדבקה מראש זכוכית.
הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול בנקודה זו, אחסן שקופיות ב--80 ° צ' עד שמוכן להמשיך.
4. הפרוטוקול vivo צביעת לשעבר
הערה: עבור השוואה כמותית בין תמונות מיקרוסקופ קרינה, כל השקופיות מוכתמות באותו הזמן עם אותם פתרונות מוכנים.
- לשטוף שקופיות רקמה קפואה עם טמפרטורת החדר PBS עבור 5 דקות כדי להסיר OCT.
- דדקייט מחתכי רקמה עם עט מחסום הידרופובי כדי להקטין את נפח הפתרונות הדרושים במהלך כתמים.
הערה: היזהרו לא לאפשר לעט לרוץ על דגימות רקמות כפי שהוא יכול להסיר את הרקמה מהשקופית או למנוע כתמים מתאימים על החלק הרקמה המושפעת. אל תאפשר לפרקי הרקמה להתייבש בכל נקודה. - תקן את מקטעי הרקמה עם פתרון פאראפורמלדהיד 4% עבור 5 דקות.
- לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 5 דקות.
- החדירות סעיפים עם 0.5% טריטון-X 100 ב PBS עבור 15 דקות.
- לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 5 דקות.
- לחסום את הרקמות עם 3% w/v סרום שור (BSA) ו 5% v/v סרום עז, הן ב-PBS (פתרון חסימת) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
הערה: התאם את סרום הפתרון לחסימה לבעל החיים המשני של הנוגדן. - לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 5 דקות.
- מקטעים מבית הכלא עם שמירה על נוגדנים ראשוניים כרצונכם, אולי גרעין נפוץ (g., DAPI), כלי דם (g., CD31), או סמן cytoplasmic (למשל, actin). כאן, עכברוש נגד עכבר CD31 (סמן כלי דם) ב 1:100 דילול שימש על פי הוראות היצרן בפתרון חסימת לילה ב 4 ° c מוגן מהתייבשות על מגש השקופית.
הערה: אין להוסיף נוגדן ראשי או מקשור נוגדן נוסף. המשלים שהוזרק ומותר לצבור ברקמות בvivo לפעול כמו הנוגדן העיקרי. - לשטוף את השקופיות ב-PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים, ולשנות את ה-PBS בכל פעם.
- המדגירה שקופיות עם נוגדנים משניים כדי לתייג נוגדנים ראשוניים. עבור יישום זה, המחש anti-B7-H3 הנוגדן באמצעות AlexaFluor-546 עז מצודת אנטי ארנבת נוגדן (1:200 דילול, אופטימיזציה על פי הוראות היצרן) ו CD31 עם AlexaFluor-488 עז אנטי עכברוש נוגדן משני (1:200 דילול, ממוטב לפי הוראות היצרן) בפתרון חסימה, מוגן מפני אור והתייבשות על מגש השקופית, עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
הערה: נוגדנים משניים הם מאותו בעל חיים מארח אבל להתאים את הזיקה של הנוגדנים המשני למינים המארחים של הנוגדן העיקרי המתאים. השקופיות מוגנות מאור מנקודה זו ואילך. - לשטוף את השקופיות ב-PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים, ולשנות את ה-PBS בכל פעם.
- להחיל טיפה אחת של מדיום ההרכבה לתוך מרכז פרוסת הרקמה ובזהירות המקום coverslip הימנעות מלכודת של בועות אוויר.
- לאטום את קצות שמיכות עם לק ציפורניים ברור ולאפשר ייבוש.
הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול של עד שבוע בנקודה זו, אחסן שקופיות ב-20 ° c עד שתהיה מוכן להמשיך.
5. הדמיה מיקרוסקופית הקונפוקלית וניתוח תמונה כמותי
הערה: הכנת מיקרוסקופ הקונמוקד ופרמטרי הדמיה יהיו תלויים במערכת החיבור המשמשת. המיקרוסקופ המשמש כאן נרכש מסחרית (למשל, Zeiss LSM 510 Meta system) ואת תוכנת הרכישה המשויכת שימש (למשל, זן 2009). עם זאת, רבים מהצעדים הללו יחולו על כל מיקרוסקופ קונמיוקדי ומניחים ידע בסיסי במיקרוסקופיה.
- לאחר הפעלת המערכת והתחמם, בחר את המטרה הרצויה; כאן 20x (הצמצם המספרי = 0.8) המטרה היתה בשימוש.
- טען שקופית בקרה חיובית, כיסוי למטה, כדי לאפשר הגדרת אופטימיזציה עבור האות הבהיר ביותר. הדמיה בערוץ האדום, למקד את המערכת על המדגם במצב הדמיה חיה .
- עבור כל ערוץ לייזר המשמש, למטב את עוצמת הלייזר, הרווח הראשי, וגודל הנקב כדלקמן:
- מעבר למצב רציף עבור דימות.
- מטב את עוצמת הלייזר (השולטת בעוצמת הלייזר) והרווח (המאסטר) (השולט במתח של שפופרת פוטוטיפייר) תוך כדי ניטור ההיסטוגרמה של הצגת הטבלה (lut). כוונן שתי הגדרות אלה עד שהטווח הדינאמי של ההיסטוגרמה יתמלא ללא הפחתה בפיקסלים.
הערה: אם עוצמת הלייזר גבוהה מדי הלבנת התמונות תתרחש. אם הרווח (מאסטר) גבוה מדי, התמונה תהיה רועשת. באופן אידיאלי, הרווח (Master) יהיה באמצע הטווח שלו. - הגדר את היחידה האוורירית ליחידת המאוורר (AU), המספקת את הרזולוציה הגבוהה ביותר ואת החלק הדק ביותר של z-slice.
- החלק את פס ההסטה הדיגיטלית כדי למזער את רצפת הרעש בהיסטוגרמה lut לרקע שחור אמיתי.
הערה: לאחר שהגדרות המיקרוסקופיה ממוטבות לכל ערוץ לייזר ולמטרה, השאר אותם קבועים במהלך הפעלת ההדמיה ועבור הדמיה של כל השקופיות, כדי לאפשר השוואה כמותית בין שקופיות.
- תחת הכרטיסיה מצב רכישה , תחת ממוצע בממוצע, בחר את המספר ועומק הסיביותהרצויים. לחצו על הלחצן ' אופטימלי ' לקביעת גודל הפיקסל האופטימלי.
- השתמש בלחצן הצמד רכישה כדי לאסוף תמונה באיכות גבוהה. כאן, שדות השקפה אקראיים נבחרו מתוך הגידול, אבל תחומי עניין אחרים עשויים לחול על יישומים שונים (כלי, שולי הגידול, עומק החדירה, וכו ')
- שמור קבצי תמונה בתבנית המשמשת את התוכנה הקונמוקד (כאן, ". lsm") לעיבוד וכימות לא מקוונים.
הערה: אם לא כל השקופיות מתתמונות במהלך אותה הפעלה, שמור את ההגדרות וטען אותם מחדש בביקורים הבאים, למרות שהדימות מחדש של אותה שקופית אינה מומלצת עקב הלבנת התמונות. - לבצע את מדידות כמותית בעוצמה פלואורסצנטית. פתח את פיג'י (פיג'י Is בדיוק תוכנת imagej)19,23 וטען קובץ תמונה. lsm על-ידי גרירה אל שורת המצב.
- פצל את נתוני ערוץ הצבע. עבור לתמונה ≫ ערימות ≫ ערוצים מפוצלים.
- הליך מקדים של תמונות הזריחה לפי הצורך, כלומר, הפחת את אות הרקע (תהליך ≫ חיסור רקע) או הפחת את הרעש באמצעות שיטת סינון.
- פלח את ערוץ הצבע המתאים לחלבון הייחוס (כלי דם, גרעיני, כתם תאי) על-ידי הגדרת סף בעוצמת האות (תמונה > התאם ≫ הסף).
הערה: סף ידני מציג סובייקטיביות לתוך ניתוח תמונה, לכן, באמצעות אלגוריתם סף אוטומטי או התייחסות היסטגרמות התמונה עושה תוצאות ניתוח התמונה מוטה פחות. - השתמש במסף זה כדי ליצור מסיכה בינארית (תהליך > בינארי ≫ המר למסיכה).
- מדידת ותווית ROIs בתוך המסיכה (לנתח את ≫ נתח חלקיקים > בדוק הוסף למנהל > אישור).
- החל ROIs על ערוץ הצבע המתאים לנוגדן העניין (לחץ על תמונת ערוץ, לנתח ≫ כלים > ROI Manager > מדידה). פעולה זו תחיל את ROIs של המסיכה לתמונת הנוגדן ותספק מדידות תמונה עבור מקטעי תוויות בחלון התוצאות. שמור חלון תוצאות (קובץ > שמור).
- חשב את הסטטיסטיקה הרצויה של ריבית, כגון עוצמת הזריחה הממוצע כפי שמתואר כאן24.
- בצע את כל שלבי העיבוד הזהים לכל תמונה בתוך קבוצה של שקופיות. צור מאקרו שיעשה זאת באופן אוטומטי עבור אצוות תמונה גדולה23.
- לתצוגת תמונה רק לאחר מדידות כמותית, החילו התאמות של תמונה איכותית כדי למטב את ההדמיה של תבניות biodistribution פצה על-ידי התאמת מינימום, מקסימום, בהירות וניגודיות לאותן רמות בכל השקופיות (תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות).
- המר את סוג התמונה (תמונה ≫ סוג ≫ צבע RGB) ושמור קבצים בסוג תמונה ללא אובדן נתונים, כגון. Tiff (קובץ ≫ שמירה כ> tiff...) לשימוש במצגות ובפרסומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה IVIL שימש כאן כדי לבחון את האינטראקציה vivo biodistribution תפלגות ורקמות של B7-H3-ICG ו-Iso-ICG, על ידי מתן אפשרות לסוכנים, לאחר הזרקה והזרקת לתוך בעל חיים, כדי אינטראקציה עם רקמת היעד עבור 96 h, ולאחר מכן ברגע הרקמות הן שנקטפו, כדי לשמש את הנוגדנים העיקריים במהלך vivo חיסוני ex. שיטת ה-IVIL גם הושווה התקן לשעבר vivo IF כתמים של הרקמות עבור B7-H3 סמן. בלוטות החלב של murine נורמלי לא לבטא את הסמן B7-H3, אישר vivo ex, תקן IF כתמים, ואין לצבור נוגדנים דרך מנגנונים פסיביים אחרים, ולכן, אין הצטברות של B7-H3-ICG או Iso-ICG זוהה, נציג של תוצאה שלילית (איור 1, בשורה העליונה). עם זאת, גידולים מורי הפטמות מבטאים B7-H3 הן בתוך הרקמות והאפיתל (כפי שאושר על ידי כתמים רגיל IF), ו-ivil הייתה מסוגלת להדגיש את הסוכן B7-H3-icg שנצבר בחוזקה על היום והיה מסוגל באופן חלקי החוצה מן יום כדי לאגד את התאים הסרטניים עצמם למרות באופן הטרוגנית לעומת התפלגות אחידה של הסמן B7-H3 לאורך כל הגידולים, המוצג גם באיור 1, השורה התחתונה. יתרה מזאת, למרות שלסוכן Iso-ICG אין שום פרט מולקולרי, הוא עדיין הוצג להצטבר בצורה לא ספציפית, עקב אינטראקציות Fc, ניקוז ביניים לקויה, החדירות המשופרות ואפקט השמירה בתוך הפטמות המורריות גידולים (איור 1). הבדל זה מודגש בתבניות הביוהפצה המוצגות בין שני הסוכנים, ומשפר את תוצאות האיגוד הספציפיות של סוכן הנוגדן הספציפי, ומייצג שתי תוצאות אפשריות של תוצאה חיובית.
The B7-H3-ICG התוצאות הנציג להדגים כיצד השיטה IVIL ניתן להשתמש כשיטה איכותית כדי לתאר נוגדן כללי/נוגדנים המשלים ביולוגי. עם זאת, לעיתים, ניתן לדרוש פרשנות כמותית יותר, או נוגדן עשוי להיות רגיש מאוד, יכולת קשירה מסוימת. במצבים אלה, הארגון יכול גם לספק את המידע הרצוי. בדוגמה השנייה, שבה הביטוי של חלבון נטרין-1 ברקמות הגידול ושיתוף ההתאמה שלה עם CD31-חיובית הגידול האנדויום היה ללמוד, טכניקת IVIL היה גם בהצלחה הוחל19.
נטזה-1 הוא חלבון 65 kda מופרש אשר התבטא מעל סוגים מסוימים של סרטן כגון סרטן השד גרורתי25,26. על מנת לפתח גישה להדמיה מולקולרית לנטרין -1, בזמינות vivo של החלבון הייתה צריכה להיקבע19. כמו כן, כמו נוגדן אנטי-נטרין-1 אין מספיק אהדה עבור אנטיגן שלה לאחר קיבוע רקמות, פרוטוקול כתמים חלופיים לאימונוהיסטוכימיה קלאסית או IF כתמים היה נדרש IVIL היה מיושם. הומניזציה אנטי-נאלית-1 נוגדן ונוגדן האדם igg השליטה האנושית היו מוזרק באופן מידי 24 שעות לפני זלוף לב ואיסוף הגידול. זלוף לב הוחל כדי להפחית את מכתים הרקע לא ספציפי ב יום כדי לשפר את הזיהוי של הצטברות נוגדן אנטי משמעותית-1 משמעותי בהשוואה לאות נוגדנים שליטה isotype כאשר ביטוי היעד הוא מוגבל. סעיפים הגידול היו מתויג ex vivo עם ואסילטורה הדגשת אנטי CD31 נוגדן (עכברוש נגד עכבר CD31 נוגדן (הטבלה של חומרים) ו נוגדנים משניים פלורסנט, אלקסה 488-מצמידים עז אנטי עכברוש igg, 1:500 דילול ו אלקסה fluor 594- מצמידים עז אנטי אנושיים IgG, 1:500 דילול בהתאמה) שימשו כדי לחשוף אנטי-נטרין-1/isotype ו anti-CD31 mAbs. האות של כוונת הקרינה הפלואורסצנטית של הנוגדן נגד נטרין-1 ו-isotype היו כמותית כדי לקבוע הבדלים בצביעת שיתוף מקומי עם CD31. איור 2 מראה כי נוגדן אנטי-נאליות-1 שנצבר במיוחד בתא הגידול האפיתל של הגידולים Mmtv-PyMT (תוצאה חיובית), בעוד לא היה אות בלוטות החלב רגיל (תוצאה שלילית). הנוגדן שיתוף נוסף עם סמן אנדותל CD31. השוואה עם נוגדן isotype-מוזרק גידולים ובלוטות נורמלי הראו כי הצטברות אפיתל היה ספציפי רקמת הגידול. הייתה הצטברות אותות בתאי האנדותל של גידולים ובלוטות רגילות בשל כריכת כריכה (גידולים) ואינטראקציות Fc שאינן ספציפיות (גידולים ובלוטות חלב רגילות)11. כך, האות הזריחה קוונפיקציה באמצעות מסכה בינארית מבוססת CD31 היה נדרש והפגינו כי האות נוגדן אנטי נטרין -1 היה גבוה באופן משמעותי מאשר אות נוגדן בקרת שליטה ברקמת הגידול, אשר מציע netrin-1 שהצטברו במיוחד. באנדותל הגידול
איור 1 : מיקרוגרפים מייצגים של השוואת השוואה של H3 מסוים של הנוגדן B7-ICG המשלים ו-icg שליטה לא ספציפית התאמה לוקליזציה המשלים בלוטות החלב המכילים המכיל רקמות נורמלי או קרצינומה. (למעלה) בלוטות החלב מוריין נורמלי מבעל חיים הוזרק באופן מידי עם 33 μg של Iso-ICG או B7-H3-ICG (אדום) ו-מוכתם נגד CD31 (ירוק) מראה כתמים של שערי הנוגדן. רקמות נורמלי הוכחו כי אין ביטוי של B7-H3 על-ידי רגיל ex vivo אם כתמים. (למטה) גידולים בפטמות פולשנית מבעל חיים הוזרק באופן מבוקר עם 33 μg של B7-H3-ICG או Iso-ICG (אדום) ומוכתם כלי דם CD31 (ירוק) מראה נרחב, כתמים הטרוגנית, למרות עם דפוסי הפצה שונים, הן B7-H3-ICG ו סוכני Iso-ICG. B7-H3-ICG מאגד בחוזקה לתוך ואצלב, הנקודה הראשונה של המגע ב vivo, ולאחר מכן הוא מסוגל לעבור את הכתם מן הוואקלטיום כדי להכתים את הסרטן האפיתל הגידול. Iso-ICG מראה הצטברות לא ספציפית בתוך רקמות הגידול. תקן רגיל ex vivo IF מראה ביטוי אחיד של הסמן B7-H3 על תאים אפיתל ואנדותל. צבע צהוב מצביע על אות ערוץ אדום וירוק המותאם לשיתוף. סרגל קנה מידה הוא 100 יקרומטר ועקבי בין לוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : ב vivo-לוקליזציה של נטרין-1 ב-MMTV-PyMT גידולים בפטמות. (משמאל) מיקרוגרפים מייצגים של שיטת האיקוויל לגילוי ביטוי מסוג נרגיל-1 (אדום) או ביטוי שליטה (אדום) בקרצינומה של מורטין ובלוטות החלב הרגילות. הארגון מאשר את אות האפיתל עבור הנטרין -1 בגידולים MMTV-PyMT, אך לא בבלוטות החלב הרגילות, ואות הנטרין-1 חזקה על תאי האנדותל (CD31 כתמים, ירוק) בגידולי השד ובאות חלשה באופן משמעותי של נטרין-1 בבלוטות החלב הרגילות. צבע צהוב מצביע על אות ערוץ אדום וירוק המותאם לשיתוף. פסי סרגל מציינים 20 μm. לאיתור חלבון מסוג netrin 1 באנדותל הגידול, 100 μg של הומניזציה הראשי NET1-H-mAb או 100 μg של האדם האנטי IgG isotype שליטה היו מוזרק 24 שעות לפני איסוף הגידול. הנוגדן במחזור חופשי הוסר על ידי זלוף לב עם ה-PBS ורקמת הגידול היה מבודד, הבזק קפוא, ו מנות ב 15 יקרומטר עובי על קריוסטט. תאים אנדותל היו מסומנים עם הנוגדן הראשי נגד העכבר CD31 ואחריו על ידי אלקסה משנית 488 מצמידים עז אנטי עכברוש IgG. כדי לחשוף את הנוגדן העיקרי מיקוד netrin 1, משני אלקסה Fluor 594-מצמידים עז אנטי-אדם החיים IgG היה שימוש. כדי למנוע אינטראקציה מסויימת של הנוגדנים המשניים של העז, דגימות הרקמה נחסמו באמצעות סרום עז. (מימין) גרף עמודות המדגיש את כימות האות אנטי-נטרין-1 או איזוסוג של שליטה בשלט שתואם את אות הנוגדן anti-CD31. N = 13 גידולים (של שני עכברים) לכל קבוצה של MMTV-PyMT ו-N = 7 בלוטות החלב (של עכבר אחד) לכל קבוצה של בלוטות רגיל; קווי שגיאה מציגים את SEM; השוואות של שתי קבוצות נערכו עם מבחן ה-t של הסטודנט. איור מודפס עם הרשאה מ 19 תחת רישיון מלאי יצירתי CC by 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו כוללת מספר שלבים קריטיים ומחייבת שינויים פוטנציאליים כדי להבטיח יישום מוצלח. ראשית, את המינון ואת העיתוי של הנוגדן/הנוגדן המשלים ולאחר ההזרקה חייב להיות מותאם ליישום ספציפי. באופן כללי, המינונים צריך לשמש כי הם עקביים עם איך מחייב נוגדן בדרך כלל לשמש, כלומר, התאמת המינונים של הנוגדן הטיפולית או האנטי נוגדן מבוססי סוכן הניגודיות. כמו כן, יש לשקול בזהירות את התזמון של אוסף רקמות היעד. נוגדנים ונוגדן שערים יש פעמים המחזור הארוך יותר מאשר תרופות סטנדרטיות וסוכני ניגודיות, עם זאת, אלה הם משתנים מאוד צריך להיות ממוטב עבור היישום הרצוי, אבל מומלץ לאפשר לפחות 24 h מחזור הזמן27 . שנית, במהלך איסוף רקמת היעד, ייתכן שתידרש ליישם טכניקת היתוך תאיים כדי להסיר נוגדן מחזורי בחופשיות מבריכת הדם19. בזמן שהוא מסתכל על התפלגות הגידול של B7-H3-ICG, זה נמצא מיותר בשל פעמים ארוכות מספיק המחזור (96 h) ואת הלוקליזציה extravascular של הסוכן. עם זאת, עבור היישום הנטרין-1 של שיטת IVIL א, הפרזיה קרדיולוגית נחשבה לרלוונטית בשל הביטוי האנדותל של הנטרין-1 ורמת הביטוי הנמוכה יחסית שלה. השלישי, במהלך מכתים רקמות לשעבר vivo זה הכרחי להכתים את כל השקופיות כי יהיה להשוות כימות במהלך הפעלה זהה עם פתרונות זהים כדי למנוע נורמלי וריאציות בין אצווה. ודא שהשקופיות שוטפים כראוי בין השלבים ופתרון העט של ההידרופובי אינו בא במגע עם הרקמה כדי למנוע כתמים מרביים. לבסוף, במהלך המיקרוסקופיה, יש לשמור על אותן הגדרות דימות בין השקופיות כדי לאפשר כימות יחסית ולעבוד במהירות כדי למנוע הלבנת שקופיות. נקודות מפתח אלה יגבירו את הסבירות למימוש מוצלח של IVIL.
ישנם מספר יתרונות לשיטת ה-IVIL. ראשית, בעוד שהשיטה דומה לשיטות הסטנדרטיות של IF, השניים מספקים מידע שונה באופן משמעותי. אם הצביעת מציינת את המיקום האנטומי של סמנים מולקולריים בתוך הרקמה בנקודת זמן נתונה (כאשר הרקמה נאספה ותוקן). עם זאת, IVIL מספק מידע על איך נוגדן או המשלים הנוגדן, כפי שמתואר על ידי הלוקליזציה של B7-H3-ICG, הוא הפצה ואינטראקציה, אם כי להיות ספציפי או לא ספציפי הצטברות, הפנמה, או שמירה ביעד רקמות. זה קריטי למחקרים פרמקוקינטיים/דינמיים וביולוגיים. שנית, מסורתית IF שיטות הן, לעתים, מוגבל על ידי קיבוע של רקמות אשר יכול לגרום לעיוות אנטיגן או מיסוך מניעת כריכה על ידי הנוגדן העיקרי28. לכן, IVIL יכול להיות שימושי כאשר כתמים סטנדרטיים IF או אימונוהיסטוכימיה להיכשל. טכניקת IVIL יכול להיחשב שיטה משלימה כדי לוודא בפעילות נוגדן vivo שאחרת יהיה בלתי ניתן לגילוי. לבסוף, אלה מוכרים עם טכניקות מסורתיות IF הצביעת ימצאו את השיטה פשוט בביצוע ויהיה להם את רוב החומרים הנדרשים על יד.
. לשיטת האיקוויל יש מספר מגבלות ראשית, בגלל הצורך להרדים את החיה כדי לקצור את רקמות היעד, IVIL מספק רק מידע אינטראקציה ביולוגית בנקודת זמן אחת. הזרקת הנוגדן העיקרי או המשלים בנקודות זמן שונות לתוך בעלי חיים שונים יאפשר חלון זמן רחב יותר של מידע על התפלגות biodistribution vivo אינטראקציה. שנית, אם משתמשים אינם מכירים בטכניקות בעלי חיים vivo, כגון הזרקת וריד הזנב או היכולת הפוטנציאלית של הזרם האחורי, זה יכול להיות מגבלה על השיטה. שיטות אלה דורשות מאנשים מיומנים לבצע באופן אמין. עם זאת, השימוש קטטר במהלך הזרקת וריד הזנב מבטיח הניהול של המינון כולו כמו מיקום המחט הנכון יכול להיות מאושר לפני ההזרקה. בנוסף, חלופה אחת הזרקת וריד הזנב כי יכול להיחשב הוא רטרו מסלולית הזרקה, אשר בדרך כלל יש שיעור הצלחה גבוהה יותר עם צוות מנוסה פחות. הצורך להכתים ולדמות את כל שקופיות רקמות באותה אצווה כדי לאפשר הערכה כמותית מגביל את מספר דגימות וסמנים שניתן לכלול במחקר אחד. המחקר עשוי להיות צריך להיות מאורגן לתוך מכתים סדרתי בימים שונים על פרוסות רקמה סמוכים כדי לאסוף את המידע הרצוי. לבסוף, השימוש של מינים מתאימים נוגדנים, כלומר, מורנין נוגדנים נגד העכבר במודלים קדם קליני מורטין, מעלה בעיה של מכתים רקע לא ספציפי עם נוגדנים משניים. לפיכך, השימוש של מינים-נוגדנים ראשוניים העיקרי נדרש כפי שהוצג במחקר זה, או באמצעות התווית באופן שכותרתו מינים בהתאמה נוגדנים העיקרי צריך לשמש.
טכניקת ה-IVIL היא שימושית לניתוח ביולוגי של נוגדנים מאבחן וטיפולי ליישומים רבים. יישומים שונים עבור הנוגדן ולעירוי או הזרקה וניתוח רקמות vivo ex דווחו בעבר ולאשר את העניין הנרחב להציג את הליך זה כתמים. רוברטסון ועמיתיו התוויות רכיבי כלי דם כגון נימים אנדותל וכלים גדולים יותר עם זריקות ורידי של Lycopersicon esculentum (עגבניות לקטין)29. הטכניקה הייתה תואמת להיסטליזם ואימונולוציטוכימיה והתגלתה דפוסי כלי דם ומאפייני מאפיינים פונקציונליים. למרות, השימוש של ליגניות פלורסנט היה מוגבל על ידי השפלה מהירה של זריחה עם הזרקה30. כפי שמתואר בפרוטוקול IVIL הזריקה של הנוגדן העיקרי vivo ואחריו לשעבר תיוג vivo עם נוגדן פלורסנט משני יכול להיות גישה חזקה יותר. יישום נוסף מעניין של סוג זה של vivo IF כתמים הוא תיוג של לימפוציטים intravascular כפי הפגינו על ידי אנדרסון ועמיתיו31. נוגדן מוזרק באופן פנימי השתמשו כדי לתייג לימפוציטים מקומי בכלי הדם, אשר נאספו לאחר מכן מעובד עוד יותר עבור הניתוח cy, try הזרימה של סמנים אימונולוגיים. לבסוף, כדי להעריך את המסירה ואת הלוקליזציה היסטולוגית של therapeutics נוגדן שנמסרו לחולים עם הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC), מחקר הראשון באדם של התפלגות נוגדנים בוצעה באמצעות מערכת מערכתית מנוהל כמעט אינפרא אדום ומתויג נוגדן טיפולית cetuximab-IRDye800CW32. הנתונים הושוו עם ניתוחים היסטלוגיים והראו כי אות הפלורסנט ירד במרחק מן הגידול המאשר ספציפיות. למרות, הנוגדן הטיפולית לא להגיע לכל האזורים של ביטוי אנטיגן, במיוחד את אזורי הגידול הבדיל עם רמות גבוהות של קולטן גורם הגידול באפידרמיס (EGFR) אנטיגן. בהקשר הנוכחי של מחקר הסרטן התמקדות בפיתוח של טיפולים ייעודיים וטיפולים חיסוני הנתקלים התנגדות חזקה וחוסר יעילות, השיטה IVIL יהיה כלי מצוין כדי ללמוד את התפלגות של נוגדנים טיפולית כגון pd-1/pd-L-1 או HER233,34. תוצאות אלה הן בעלות ערך רב כדי להבין מדוע טיפולים ייעודיים יעילים במקרים מסוימים המקדם את ההתפתחות של גישות הרומן. יחד עם זאת, דוגמאות אלה מדגישות את החשיבות הפוטנציאלית של גישת ה-IVIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים ד ר אנדרו אולסון (סטנפורד שירות מיקרוסקופ מדעי המוח) עבור דיונים ושימוש בציוד. אנו מודים לד ר ג'ורגן ק. ווילמן למנטוריו. מחקר זה נתמך על ידי NIH R21EB022214 מענק (קיו), NIH R25CA118681 מענק הכשרה (קיו), ו-NIH K99EB023279 (קיו). שירות מיקרוסקופ המוח של סטנפורד נתמך על ידי NIH NS069375.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N.
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al.
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B.
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
