新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析
Summary
我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。
Abstract
広範な全ゲノムシーケンシングは、多くの潜在的なタンパク質を提供する多くのオープンリーディングフレーム(ORF)を同定しました。これらのタンパク質は、細胞に重要な役割を持ち、新しい細胞プロセスを解明する可能性があります。タンパク質の中でも、キナーゼは細胞シグナル伝達経路に属し、細胞の成長、分裂、分化、運動性、死など、細胞の運命に不可欠な多くのプロセスをオンまたはオフにする能力を持つ主要なアクターです。
本研究では、新しい潜在的なキナーゼタンパク質LIMK2-1に着目した。我々は、特定の抗体を用いてウェスタンブロットがその存在を実証した。我々は、共免疫沈殿実験を用いて上流調節タンパク質との相互作用を評価した。共免疫沈殿は、2つの標的タンパク質間の相互作用を検出できる非常に強力な技術です。また、餌タンパク質の新しいパートナーを検出するために使用されてもよいです。餌タンパク質は、その配列に対して設計されたタグを介して、またはそれを特異的に標的とする抗体を介して精製されてもよい。これらのタンパク質複合体は、SDS-PAGE(ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル)によって分離され、質量分析法を用いて同定され得る。免疫沈殿LIMK2-1はまた、γ[32P]ATP標識によってインビトロでのキナーゼ活性を試験するためにも使用された。この確立されたアッセイは、多くの異なる基板を使用し、また、餌の変異バージョンを使用して、特定の残基の役割を評価するために使用され得る。薬理学的薬剤の効果は、この技術は、非常に敏感かつ定量的であるため、評価されることもできます。それにもかかわらず、放射能処理には特に注意が必要です。キナーゼ活性はまた、修飾アミノ酸のリン群を標的とする特異的抗体で評価されてもよい。これらの種類の抗体は、すべてのリン修飾残渣について市販されているわけではない。
Introduction
何十年もの間、多数のシグナル伝達経路が解明され、細胞分裂、分化、運動性、プログラムされた細胞死、免疫および神経生物学などの重要な細胞プロセスへの関与が示されている。キナーゼは、多くの場合、活性化または不活性化を細かく調節し、外部刺激1、2、3に応答する一過性汎用性の高い複合体の一部であるとして、これらのシグナル伝達経路において重要な役割を果たす。キナーゼの突然変異および調節不変は、しばしばヒトの疾患を引き起こすため、過去40年間で最も重要な薬物標的の一つとなっている4.
この文脈では、上流のレギュレータや下流の基板とのキナーゼ相互作用を検出し、新しいパートナーを特定できることが重要です。アフィニティ精製および免疫沈殿は、タンパク質複合体5の単離のための非常に強力な技術である。餌タンパク質またはキナーゼは、ペプチドを標的とする抗体と共有結合した市販ビーズの使用を可能にする特定のペプチド配列でタグ付けされてもよい。この材料は実験6、7、8の高い再現性を可能にする。内因性タンパク質は、餌タンパク質を直接標的とする抗体を用いて免疫沈殿することもできる。抗体は、タンパク質Aまたはタンパク質Gアガロースビーズに架橋されるか、または単にリサートを添加する前にこれらのビーズでインキュベートされてもよい。溶解バッファーは、相互作用を失うことなくタンパク質可溶化を可能にし、タンパク質の劣化を避けるために最適化する必要があります。このアプローチの主な欠点は、相互作用が細胞リシス時に検出されるということです。したがって、一時的または弱い相互作用は、細胞内のコンテキストを必要とする相互作用と共に見逃される可能性があります。その他の技術は、近接リゲーションアッセイ(PLA)9、生体内架橋支援親和性精製(XAP)10、生物発光共鳴エネルギー伝達(BRET)またはフェルスター共鳴エネルギーなどの細胞で直接働くために使用することができる。転送 (FRET)11,12.さらに、免疫沈殿は、表面プラズモン共鳴、イソテル微量カロリーム、マイクロスケール熱泳動などの物理的な技術が必要とされる結合の熱力学的定数を決定することは適切ではありません。13、14.
キナーゼ活性は、複数の技術を用いて評価されてもよい。本明細損では、ホスホ特異的抗体およびインビトロγ[32P]ATP(アデノシン三リン酸)標識に焦点を当てた。リン特異的抗体は、タンパク質内の特定の残留物のリン酸修飾を標的とする。それらは、細胞リシス後のウェスタンブロットまたはELISA(酵素結合免疫ソルベントアッセイ)、免疫組織化学、およびフローサイトメトリーまたは免疫蛍光を用いた無傷の細胞に使用することができる。彼らの欠点は、標的タンパク質の変異バージョンを使用して評価することができ、特異性の欠如を含むことができ、およびそれらのすべてのタンパク質に市販されていない。インビトロγ[32P]ATP標識は、非常に堅牢で、確立された、高感度な方法15である。免疫沈殿タンパク質または組換えタンパク質を使用して、異なる基質を試験してもよい。薬物の効果は、この方法が定量的であるとしても評価されてもよい。その主な欠点は、アプローチに関連する放射能は慎重に処理する必要がある点です。蛍光または発光ペプチド基質の測定に基づいて、リン酸化時に変化した蛍光/発光特性を利用する代替方法も可能です。このような方法はまた、高いスループットを可能にし、これは、例えば、標的キナーゼの潜在的な阻害剤でありうって可能な分子のスクリーニングにおいて必要とされる。実際、キナーゼは製薬会社16が追求する最大級の薬剤標的の1つである。
本研究では、LIMK2-1タンパク質(LIMK2-1はLin11、アイル1、Mec3キナーゼアイソフォーム2-1を表す)に着目した。LIMK2キナーゼタンパク質は、1995年17月に最初に記載された。LIMK2の3つのアイソフォームは、LIMK2a、LIMK2bおよびLIMK2-1の代替スプライシングによって生成される。現時点では、LIMK2-1は単一の研究18においてmRNAレベルでのみ記載されている。本明細物では、堅牢な生化学的アプローチを用いて、この潜在的な新しいキナーゼタンパク質を分子レベルで特徴付ける。まず、LIMK2-1が実際に合成されたことを示す。LIMK2aおよびLIMK2bの2つの対応するのと同様に、上流のキナーゼROCK(Rho関連タンパク質キナーゼ)と相互作用する。LIMK2-1はミエリン基本タンパク質(MBP)にキナーゼ活性を有するが、LIMキナーゼの正規基質であるコフィリンには活性を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細物では、我々は、その配列およびそのホモログ、LIMK2aおよびLIMK2b20に基づいてキナーゼであると考えられる新しいタンパク質LIMK2-1を分子レベルで特徴付けるために堅牢な生化学的ツールを使用した。
まず、特定の抗体を用いたウエスタンブロット分析を用いてタンパク質レベルでLIMK2-1の存在を実証した。その後、LIMK2aとLIMK2bを調節することが知?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ラ・リーグ・コントル・ル・ガン、ラ・アソシエーション・ニューロフィブロマトース、レックリングハウゼン、ラ・レジオン・センター・ヴァル・ド・ロワールによって支援されました。フローサイトメトリーデータのためのオーレリー・コッソンとデボラ・カサス、そして原稿の徹底的な校正のためのキーロン・ヒックマン・ルイスに感謝します。
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
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