Summary

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Published: June 30, 2019
doi:

Summary

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.

Abstract

O sequenciamento do genoma inteiro extenso identificou muitos quadros de leitura abertos (ORFs) que fornecem muitas proteínas potenciais. Estas proteínas podem ter papéis importantes para a célula e podem desvendar novos processos celulares. Entre as proteínas, as cinases são atores principais como eles pertencem a vias de sinalização celular e têm a capacidade de ligar ou desligar muitos processos cruciais para o destino da célula, como o crescimento celular, divisão, diferenciação, motilidade, e morte.

Neste estudo, nós focamos em uma proteína potencial da quinase nova, LIMK2-1. Nós demonstramos sua existência por Western blot usando um anticorpo específico. Nós avaliamos sua interação com uma proteína de regulamento ascendente usando experimentos da coimunoprecipitação. A coimunoprecipitação é uma técnica muito poderosa capaz de detectar a interação entre duas proteínas alvo. Ele também pode ser usado para detectar novos parceiros de uma proteína de isca. A proteína da isca pode ser purificada quer através de uma etiqueta projetada para sua seqüência ou através de um anticorpo especificamente direcioná-lo. Estes complexos proteicos podem então ser separados por SDS-PAGE (gel de PolyAcrylamide do sulfato do Dodecyl do sódio) e identificados usando a espectrometria maciça. Immunoprecipitated LIMK2-1 foi usado igualmente para testar sua atividade da quinase in vitro pela rotulagem do ATP de γ [32P]. Este ensaio bem estabelecido pode usar muitos substratos diferentes, e versões mutadas da isca podem ser usadas para avaliar o papel de resíduos específicos. Os efeitos dos agentes farmacológicos também podem ser avaliados, uma vez que esta técnica é altamente sensível e quantitativa. No entanto, o manuseio de radioatividade requer cautela especial. A atividade da quinase pode igualmente ser avaliada com os anticorpos específicos que visam o grupo do phospho do aminoácido modificado. Estes tipos de anticorpos não estão disponíveis comercialmente para todos os resíduos de fosho modificados.

Introduction

Durante muitas décadas, inúmeras vias de sinalização foram elucidadas e seu envolvimento em processos celulares cruciais, como divisão celular, diferenciação, motilidade, morte celular programada, imunidade e neurobiologia, tem sido demonstrado. As quinases desempenham um papel significativo nessas vias de sinalização, pois muitas vezes regulam finamente sua ativação ou inativação e fazem parte de complexos versáteis transitórios que respondem a estímulos externos1,2,3. A mutação e o desregulação das quinases conduzem frequentemente às doenças nos seres humanos, e tornaram-se conseqüentemente um dos alvos os mais importantes da droga sobre os 40 anos passados4.

Neste contexto, é importante ser capaz de detectar a interação quinase com seus reguladores upstream ou substratos a jusante e identificar novos parceiros. A purificação de afinidade e a imunoprecipitação são técnicas muito poderosas para o isolamento de complexos proteicos5. A proteína ou quinase da isca pode ser etiquetada com uma seqüência específica do peptide permitindo o uso de grânulos comerciais covalentemente acoplado com os anticorpos que alvejam o peptide. Este material permite uma alta reprodutibilidade em experimentos6,7,8. As proteínas endógenas também podem ser imunoprecipitadas usando anticorpos direcionados diretamente à proteína de isca. Os anticorpos podem ser reticulados aos grânulos de agarose da proteína A ou da proteína G ou simplesmente incubado com estes grânulos antes de adicionar o lysate. Os buffers de Lise devem ser otimizados para permitir a solubilização de proteínas sem perder a interação e evitar a degradação da proteína. Uma desvantagem principal desta aproximação é que a interação está detectada em cima da lise da pilha; Conseqüentemente, as interações transientes ou fracas, junto com aquelas que exigem o contexto subcellular podem ser perdidas. Outras técnicas podem ser usadas para trabalhar diretamente na célula, como o ensaio de ligadura de proximidade (PLA)9, a purificação de afinidade assistida por ligação cruzada in vivo (xap)10, transferência de energia de ressonância de BIOLUMINESCÊNCIA (BRET) ou energia de ressonância de Förster Transferência (fret)11,12. Além disso, a imunoprecipitação não é apropriada para determinar as constantes termodinâmicas da ligação, para as quais são necessárias técnicas físicas como ressonância Plasmon superficial, Calorimetria de Titulação Isotérmica ou Termoforese em microescala 13,14.

A atividade da quinase pode ser avaliada usando várias técnicas. Nisto, nós focamos em anticorpos phospho-específicos e in vitro γ [32P] ATP (triphosphate de adenosina) que etiquetam. Os anticorpos phospho-específicos alvejar a modificação do fosfato de um resíduo particular dentro de uma proteína. Podem ser usados no borrão ocidental ou no ELISA (ensaio enzima-lig de ImmunoSorbent) após o lysis da pilha, para immunohistochemistry, e igualmente em pilhas intactas usando a citometria ou a imunofluorescência do fluxo. Suas desvantagens podem incluir sua falta de especificidade, que pode ser avaliada usando uma versão mutada da proteína alvo, e sua não estar disponível comercialmente para todas as proteínas. In vitro γ [32P] a rotulagem ATP é um método muito robusto, bem estabelecido e altamente sensível15. Proteínas imunoprecipitadas ou recombinantes podem ser usadas, e diferentes substratos podem ser testados. Os efeitos das drogas também podem ser avaliados, pois esse método é quantitativo. Sua principal desvantagem é que a radioatividade associada à abordagem requer manuseio com cautela. Os métodos alternativos são igualmente possíveis baseados na medida de substratos fluorescentes ou luminescentes do peptide e aproveitando-se de propriedades fluorescentes/luminescentes alteradas em cima do phosphorylation. Tais métodos também permitem alta taxa de transferência, o que é necessário, por exemplo, na triagem de moléculas que podem ser potenciais inibidores da quinase-alvo. De fato, as quinases representam uma das maiores classes de alvos de drogas perseguidos pelas empresas farmacêuticas16.

Neste estudo, nós focamos na proteína LIMK2-1 (LIMK2-1 significa Lin11, Isle1, Mec3 isoforma da quinase 2-1). A proteína da quinase LIMK2 foi descrita pela primeira vez em 199517. Três isoformas de LIMK2 são produzidas por splicing alternativo: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Presentemente, LIMK2-1 foi descrito somente no nível do mRNA em um único estudo18. Nisto, nós caracterizamos esta proteína nova potencial da quinase no nível molecular usando aproximações bioquímicas robustas. Em primeiro lugar, demonstramos que LIMK2-1 é de fato sintetizado. Semelhante às suas duas contrapartes, LIMK2a e LIMK2b, interage com a quinase ascendente ROCK (proteína quinase associada a Rho). Nós mostramos LIMK2-1 tem uma atividade da quinase na proteína básica de myelin (MBP), mas não no cofilin, o substrato canônico de LIM kinases.

Protocol

1. preparação da pilha para o transfection Cuidado: todas as etapas da cultura da pilha devem ser executadas em um laboratório dedicado, e as pilhas são manipuladas dentro de um armário microbiológico da classe 2. Semente HEK-293 (rim embrionário humano) células em placas de Ø 10 cm em 10 mL de DMEM (Dulbecco ‘ s Modified Eagles médio) suplementado com 10% de soro de bezerro fetal. Cultura para 3 a 5 dias 5% CO2, em 37 ° c, até que as pilhas alcancem a confluê…

Representative Results

A proteína LIMK2-1 é sintetizadaLIMK2-1 é mencionado nos databanks, mas assim distante somente um papel mostrou a existência de seu mRNA18. Comparado a seus dois homologs, LIMK2a e LIMK2b, LIMK2-1 tem um domínio extra do C-terminal identificado como um domínio Inibidório da proteína phosphatase 1 (PP1i). Nós projetamos um anticorpo que segmenta um peptide deste domínio, ácidos aminados 671-684 (Figura 1a…

Discussion

Neste documento, utilizamos ferramentas bioquímicas robustas para caracterizar no nível molecular uma nova proteína, LIMK2-1, que se acredita ser uma quinase baseada em sua seqüência e em seus homologs, LIMK2a e LIMK2b20.

Primeiramente, nós Demonstramos a existência de LIMK2-1 no nível da proteína usando a análise ocidental do borrão com um anticorpo específico. Em seguida, avaliamos sua interação com a quinase upstream ROCK1, que é conhecida por regular …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por la Ligue contre le Cancer, L’ Association neurofibromatoses et Recklinghausen, e la Région Centre Val de Loire. Muito obrigado a Aurélie Cosson e Déborah casas para dados de citometria de fluxo, e a Keyron Hickman-Lewis para revisão minuciosa do manuscrito.

Materials

Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for g[32P] labeling
g[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for g[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
b-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
b-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for g[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for g[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

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Cite This Article
Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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