Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering
Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.
Abstract
Beoordeling van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) is van het allergrootste belang om te anticiperen op falen van gerichte therapieën en het ontwerp dienovereenkomstig effectieve anti-tumor strategieën. Hoewel bezorgdheid vaak wordt opgeworpen als gevolg van verschillen in monsterverwerking en diepte van dekking, de volgende generatie sequencing van solide tumoren hebben ontrafeld een zeer variabele mate van ITH over tumortypen. Het vastleggen van de genetische verwantschap tussen primaire en gemetastaseerde laesies door de identificatie van klonale en subklonale populaties is van cruciaal belang voor het ontwerp van therapieën voor aandoeningen aan de voor fase. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde patiënt mogelijk maakt. De hier beschreven experimentele aanpak integreert drie gevestigde benaderingen: histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing, en immunophenotypic analyses. Om de effecten op de detectie van subklonale gebeurtenissen te minimaliseren door ongepaste monsterverwerking, hebben we weefsels onderworpen aan zorgvuldig pathologisch onderzoek en neoplastische celverrijking. Op kwaliteit gecontroleerd DNA van neoplastische laesies en normale weefsels werd vervolgens onderworpen aan een hoge dekkings volgorde, gericht op de codeer gebieden van 409 relevante kanker genen. Terwijl we alleen naar een beperkte genomische ruimte kijken, maakt onze aanpak het mogelijk om de mate van heterogeniteit te evalueren bij somatische veranderingen (single-nucleotide mutaties en Copy-Number variaties) in verschillende laesies van een bepaalde patiënt. Door middel van vergelijkende analyse van sequentie gegevens konden we klonale versus subklonale wijzigingen onderscheiden. De meerderheid van ITH wordt vaak toegeschreven aan passagiers mutaties; Daarom gebruikten we ook immunohistochemie om functionele gevolgen van mutaties te voorspellen. Hoewel dit protocol is toegepast op een specifiek tumor type, verwachten we dat de hier beschreven methodologie algemeen toepasbaar is op andere vaste tumortypen.
Introduction
De opkomst van Next generation sequencing (NGS) heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop kanker wordt gediagnosticeerd en behandeld1. NGS gekoppeld aan multiregionale sequencing hebben blootgesteld een hoge mate van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) in vaste tumoren2, die verklaart deels het falen van gerichte therapie als gevolg van de aanwezigheid van subklonen met verschillende geneesmiddel gevoeligheid2 . Een belangrijke uitdaging van genoom-brede sequentie studies is de noodzaak om onderscheid te maken tussen passagier (d.w.z. neutraal) en bestuurders mutaties in individuele kankers3. Verschillende studies hebben inderdaad aangetoond dat, in bepaalde tumoren, passagiers mutaties rekening voor de meerderheid van ITH, terwijl de wijzigingen van de bestuurder neiging om te worden bewaard tussen laesies van dezelfde persoon4. Het is ook belangrijk op te merken dat grote mutationele last (zoals te zien in longkanker en melanoom) niet noodzakelijkerwijs een grote subklonale mutationele last2impliceert. Daarom kan een hoge mate van ITH worden gevonden in tumoren met een lage mutationele Last.
Metastasen zijn verantwoordelijk voor meer dan 90% van de kanker-gerelateerde dood wereldwijd5; Daarom is het vastleggen van de mutationele heterogeniteit van de bestuurders genen bij primaire en gemetastaseerde laesies van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve therapieën voor gevorderde-fase ziekten. Klinische sequentie wordt over het algemeen uitgevoerd op nucleïnezuren uit vaste weefsels, waardoor genoom verkenning moeilijk is vanwege de slechte DNA-kwaliteit. Aan de andere kant is de intentie van klinische sequencing om bruikbare mutaties en/of mutaties te identificeren die de responsiviteit/onresponsiviteit op een bepaald therapeutisch regime kunnen voorspellen. In de huidige stand kan sequentiëren worden beperkt tot een kleinere fractie van het genoom voortijdige extractie van klinisch relevante informatie. De overgang van DNA-profilering met een lage doorvoer (bijvoorbeeld Sanger-sequencing) naar NGS heeft het mogelijk gemaakt om honderden kankerrelevante genen te analyseren op een hoge dekkingsgraad, waardoor de detectie van subklonale gebeurtenissen mogelijk is. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde persoon mogelijk maakt. De hier beschreven methode integreert drie gevestigde benaderingen (histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing en immunophenotypic analyses) om functionele gevolgen van de geïdentificeerde variaties te voorspellen. De aanpak wordt schematisch beschreven in Figuur 1 en is toegepast op de studie van 5 gemetastaseerde gevallen van vaste pseudopapillaire Neoplasmata (spn’s) van de alvleesklier. Terwijl we de verwerking en analyse beschrijven van formalin-vaste paraffine-ingesloten (FFPE) weefsel specimens, kan dezelfde procedure worden toegepast op genetisch materiaal uit vers bevroren weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze methode maakt de identificatie mogelijk van moleculaire veranderingen die betrokken zijn bij de progressie van vaste tumoren door integratie van verticale gegevens (d.w.z. morfologie, DNA-sequencing en immunohistochemie) van verschillende laesies van een bepaalde patiënt. We toonden het vermogen van onze methode voor het opsporen van klonale en subklonale gebeurtenissen in een mutatie Silent tumor type (dat wil zeggen, SPN, Solid-pseudopapillaire neoplasma van de alvleesklier) door het ondervragen van de codeer seq…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd gesteund door het Italiaanse kanker genoom project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana ricerca cancro (AIRC; Grant No. 12182 tot en met 18178 tot en met VC), KP7-subsidie van de Europese Gemeenschap (CAM-Pac nr. 602783 tot AS). De financierings bureaus hadden geen rol bij het verzamelen, analyseren en interpreteren van gegevens of bij het schrijven van het manuscript.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
Riferimenti
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
