Summary

एक लक्षित अनुक्रमण दृष्टिकोण के माध्यम से तुलनात्मक Lesions विश्लेषण

Published: November 05, 2019
doi:

Summary

यह लेख किसी दिए गए रोगी से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और subclonal परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. हालांकि यहाँ वर्णित प्रयोगों एक विशिष्ट ट्यूमर प्रकार पर ध्यान केंद्रित, दृष्टिकोण मोटे तौर पर अन्य ठोस ट्यूमर के लिए लागू होता है.

Abstract

अंतर-ट्यूमर विषमता (ITH) का आकलन लक्षित उपचार की विफलता की आशा करने के लिए सर्वोपरि महत्व का है और तदनुसार प्रभावी विरोधी ट्यूमर रणनीतियों डिजाइन। हालांकि चिंताओं अक्सर नमूना प्रसंस्करण और कवरेज की गहराई में मतभेद के कारण उठाया जाता है, ठोस ट्यूमर की अगली पीढ़ी अनुक्रमण ट्यूमर प्रकार भर में ITH के एक उच्च चर डिग्री unraveled है. क्लोनल और subclonal आबादी की पहचान के माध्यम से प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों के बीच आनुवंशिक संबंधितता पर कब्जा अग्रिम चरण के रोगों के लिए उपचार के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम तुलनात्मक घावों के विश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जो एक ही रोगी से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और सबक्लोनल आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है। यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण तीन अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण को एकीकृत करता है: हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, उच्च कवर बहु-लेशन अनुक्रमण, और इम्यूनोफेनोटाइपिक विश्लेषण। आदेश में अनुचित नमूना प्रसंस्करण द्वारा subclonal घटनाओं का पता लगाने पर प्रभाव को कम करने के लिए, हम सावधान रोग परीक्षा और neoplastic सेल संवर्धन के लिए ऊतकों के अधीन. neoplastic घावों और सामान्य ऊतकों से गुणवत्ता नियंत्रित डीएनए तो उच्च कवरेज अनुक्रमण के अधीन था, 409 प्रासंगिक कैंसर जीन की कोडिंग क्षेत्रों को लक्षित. जबकि केवल एक सीमित जीनोमिक अंतरिक्ष को देख, हमारे दृष्टिकोण दैहिक परिवर्तन के बीच विषमता की हद तक मूल्यांकन सक्षम बनाता है (एकल-न्यूक्लिओटाइड उत्परिवर्तनों और कॉपी संख्या विविधताओं) एक दिए गए रोगी से अलग घावों में. अनुक्रमण डेटा के तुलनात्मक विश्लेषण के माध्यम से, हम क्लोनल बनाम subclonal परिवर्तन भेद करने में सक्षम थे. आईआईटीएच के बहुमत अक्सर यात्री उत्परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार है; इसलिए, हम उत्परिवर्तनों के कार्यात्मक परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का भी उपयोग करते हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट ट्यूमर प्रकार के लिए लागू किया गया है, हम आशा करते हैं कि यहाँ वर्णित पद्धति मोटे तौर पर अन्य ठोस ट्यूमर प्रकार के लिए लागू है.

Introduction

अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) के आगमन ने कैंसर का निदान और इलाज करने के तरीके में क्रांति ला दीहै 1. बहुक्षेत्रीय अनुक्रमण के साथ मिलकर एनजीएस ने ठोस ट्यूमर 2 में इंट्रा-ट्युमल विषमता (आईआईटीएच) की एक उच्च डिग्री को उजागर किया है, जो अलग दवा संवेदनशीलताकेसाथ subclones की उपस्थिति के कारण लक्षित चिकित्सा की विफलता के हिस्से में बताते हैं2 . जीनोम व्यापक अनुक्रमण अध्ययन द्वारा उत्पन्न एक महत्वपूर्ण चुनौती यात्री (यानी, तटस्थ) और व्यक्तिगत कैंसर में ड्राइवर उत्परिवर्तनों के बीच अंतर करने की आवश्यकता है3. कई अध्ययनों से वास्तव में पता चला है कि, कुछ ट्यूमर में, यात्री उत्परिवर्तन ों आईआईटीएच के बहुमत के लिए खाते हैं, जबकि ड्राइवर परिवर्तन एक ही व्यक्ति4के घावों के बीच संरक्षित किया जा करने के लिए करते हैं। यह भी ध्यान दें कि बड़े उत्परिवर्तन बोझ (के रूप में फेफड़ों के कैंसर और मेलेनोमा में देखा) जरूरी एक बड़े subclonal उत्परिवर्तन बोझ2मतलब नहीं है महत्वपूर्ण है. इसलिए, ITH के एक उच्च डिग्री कम उत्परिवर्तन बोझ के साथ ट्यूमर में पाया जा सकता है.

मेटास्टेसिस दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौत के 90% से अधिक के लिए जिम्मेदार हैं5; इसलिए, प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों के बीच ड्राइवर जीन ों की उत्परिवर्तन विषमता पर कब्जा उन्नत चरण के रोगों के लिए प्रभावी उपचार के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है। नैदानिक अनुक्रमण आम तौर पर निश्चित ऊतकों से न्यूक्लिक एसिड पर किया जाता है, जो खराब डीएनए गुणवत्ता की वजह से जीनोम व्यापक अन्वेषण मुश्किल renders. दूसरी ओर, नैदानिक अनुक्रमण का उद्देश्य कार्रवाई योग्य उत्परिवर्तनों और/या उत्परिवर्तनों की पहचान करना है जो किसी दिए गए चिकित्सीय आहार के लिए प्रतिक्रियाकी प्रतिक्रिया/अक्रियाशीलता की भविष्यवाणी कर सकते हैं। के रूप में यह खड़ा है, अनुक्रमण नैदानिक रूप से प्रासंगिक जानकारी के समय पर निष्कर्षण के लिए जीनोम के एक छोटे अंश के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है. NGS के लिए कम throughput डीएनए प्रोफाइलिंग (उदाहरण के लिए, Sanger अनुक्रमण) से संक्रमण यह कवरेज की एक उच्च गहराई पर कैंसर से संबंधित जीन के सैकड़ों का विश्लेषण करने के लिए संभव प्रदान की गई है, जो subclonal घटनाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम तुलनात्मक घावों के विश्लेषण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जो एक ही व्यक्ति से विभिन्न नमूनों के बीच क्लोनल और सबक्लोनल आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है। यहाँ वर्णित विधि की पहचान की विविधताओं के कार्यात्मक परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए तीन अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण (हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, उच्च कवर बहु-लेशन अनुक्रमण, और इम्यूनोफेनोटाइपिक विश्लेषण) को एकीकृत करता है। दृष्टिकोण योजनाबद्ध रूप से चित्र 1 में वर्णित है और अग्न्याशय के ठोस छद्म स्तंभीय नियोप्लाज्म (एसपीएन) के 5 मेटास्टैटिक मामलों के अध्ययन के लिए लागू किया गया है। जब तक हम फार्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतक नमूनों के प्रसंस्करण और विश्लेषण का वर्णन करते हैं, तो उसी प्रक्रिया को ताजा-फ्रोज़न ऊतक से आनुवंशिक सामग्री पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

अध्ययन में प्रयुक्त सामग्री एक विशिष्ट प्रोटोकॉल के तहत एकत्र की गई थी, जिसे स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति उपलब्ध थी। 1. ऊतक नमूनों के ऊतकीय …

Representative Results

अध्ययन कार्यप्रवाह चित्र 1में सचित्र है। मल्टी-लेसिस (एन जेड 13) 409 कैंसर से संबंधित जीनों के कोडन अनुक्रमों को लक्षित करने वाले 5 एसपीएन मामलों के अनुक्रमण में 8 जीनों में कुल 27 कायिक उत्परिवर्?…

Discussion

हमारी विधि किसी दिए गए रोगी के अलग घावों से ऊर्ध्वाधर डेटा (यानी, आकृति विज्ञान, डीएनए अनुक्रमण, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) के एकीकरण के माध्यम से ठोस ट्यूमर की प्रगति में शामिल आणविक परिवर्तन की पहच?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

अध्ययन इतालवी कैंसर जीनोम परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रेंट नहीं. FIRB RBAP10AHJB), एसोसिएजिन इटालियना राइसरका कांक्रो (एआईआरसी; अनुदान संख्या 12182 AS और 18178 को कुलपति के लिए), FP7 यूरोपीय समुदाय अनुदान (कैम-पैक नहीं 602783 AS के लिए). धन एजेंसियों के संग्रह, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या में या पांडुलिपि के लेखन में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software – uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

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Citazione di questo articolo
Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

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