Sammenlignende lesjoner analyse gjennom en målrettet sekvensering Approach
Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å identifisere klonal og subclonal endringer mellom forskjellige prøver fra en gitt pasient. Selv om eksperimenter beskrevet her fokus på en bestemt tumor type, tilnærmingen er bredt gjelder for andre solide svulster.
Abstract
Vurdering intra-tumoral heterogenitet (i) er av overordnet betydning for å forutse svikt i målrettede terapier og design følgelig effektive anti-tumor strategier. Selv om bekymringer er ofte reist på grunn av forskjeller i utvalg behandling og dybde av dekning, neste generasjons sekvensering av solide svulster har unraveled en svært variabel grad av i over tumor typer. Å fange de genetiske Relatedness mellom primære og metastatisk lesjoner gjennom identifisering av klonal og subclonal populasjoner er avgjørende for utformingen av terapi for fremskritt-stadium sykdommer. Her rapporterer vi en metode for sammenlignende lesjoner analyse som gjør det mulig for identifisering av klonal og subclonal populasjoner mellom ulike eksemplarer fra samme pasient. Den eksperimentelle tilnærmingen som beskrives her integrerer tre veletablerte tilnærminger: histologiske analyse, høy dekning multi-lesjon sekvensering, og immunophenotypic analyser. For å minimere virkningene på påvisning av subclonal hendelser ved upassende prøve behandling, vi utsatt vev til forsiktig patologisk undersøkelse og neoplastic celle berikelse. Kvalitetskontrollert DNA fra neoplastic lesjoner og normal vev ble deretter utsatt for høy dekning sekvensering, rettet mot koding regionene i 409 relevante kreft gener. Mens vi bare ser på et begrenset genomisk rom, gjør vår tilnærming det mulig å evaluere omfanget av heterogenitet blant somatiske endringer (nukleotid mutasjoner og kopierings nummer variasjoner) i forskjellige lesjoner fra en gitt pasient. Gjennom sammenlignende analyse av sekvensering data, var vi i stand til å skille klonal g. subclonal endringer. Flertallet av i. er ofte tilskrevet passasjer mutasjoner; Derfor brukte vi også immunhistokjemi til å forutsi funksjonelle konsekvenser av mutasjoner. Selv om denne protokollen har blitt brukt på en bestemt tumor type, forventer vi at metodikken beskrevet her er bredt gjelder for andre solide tumor typer.
Introduction
Ankomsten av neste generasjon sekvensering (NGS) har revolusjonert måten kreft er diagnostisert og behandlet1. NGS koplet til fler regionale sekvensering har eksponert en høy grad av intra-tumoral heterogenitet (i) i solide svulster2, noe som forklarer delvis svikt i målrettet terapi på grunn av tilstedeværelsen av subclones med ulike medikament følsomhet2 . En viktig utfordring utgjøres av Genova-Wide sekvensering studier er nødvendigheten av å skille mellom passasjer (dvs. nøytral) og driver mutasjoner i enkelte krefttre. Flere studier har faktisk vist at i visse svulster er passasjer mutasjoner rede for flertallet av i., mens driver endringer har en tendens til å bli bevart blant lesjoner av samme person4. Det er også viktig å merke seg at store mutational byrde (som sett i lungekreft og melanom) ikke nødvendigvis innebærer en stor subclonal mutational byrde2. Derfor kan en høy grad av i… bli funnet i svulster med lav mutational byrde.
Metastaser er ansvarlig for mer enn 90% av kreft-relaterte dødsfall over hele verden5; Derfor er det å fange opp de mutational heterogenitet av driver gener blant primær-og metastatisk lesjoner avgjørende for utformingen av effektive terapier for avanserte fase sykdommer. Klinisk sekvensering er vanligvis utført på nukleinsyre syrer fra fast vev, som gjengir Genova hele leting vanskelig på grunn av dårlig DNA-kvalitet. På den annen side er hensikten med klinisk sekvensering å identifisere praktiske mutasjoner og/eller mutasjoner som kan forutsi respons/fungere bedre til en gitt terapeutisk diett. Som det står, kan sekvensering begrenses til en mindre brøkdel av Genova for rettidig utvinning av klinisk relevant informasjon. Overgangen fra DNA-profilering med lav gjennomstrømning (f.eks. sanger sekvensering) til NGS har gjort det mulig å analysere hundrevis av kreft relevante gener på en høy deknings dybde, noe som gjør det mulig å oppdage subclonal hendelser. Her rapporterer vi en metode for sammenlignende lesjoner analyse som gjør det mulig for identifisering av klonal og subclonal populasjoner mellom ulike eksemplarer fra samme individ. Metoden beskrevet her integrerer tre veletablerte tilnærminger (histologiske analyse, høy-dekning multi-lesjon sekvensering, og immunophenotypic analyser) for å forutsi funksjonelle konsekvenser av variantene identifisert. Tilnærmingen er skjematisk beskrevet i figur 1 og har blitt anvendt på studiet av 5 metastatisk tilfeller av solide pseudopapillary svulster (SPNer) i bukspyttkjertelen. Mens vi beskriver prosessering og analyse av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vevsprøver, kan den samme fremgangsmåten påføres genetisk materiale fra fersk-frosset vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår metode gjør det mulig å identifisere molekylære endringer involvert i progresjon av solide svulster gjennom integrering av vertikale data (dvs. morfologi, DNA-sekvensering, og immunhistokjemi) fra forskjellige lesjoner av en gitt pasient. Vi demonstrerte evnen til vår metode for å oppdage klonal og subclonal hendelser i en mutational lydløs tumor type (dvs. SPN, solid-pseudopapillary neoplasma i bukspyttkjertelen) ved forhører koding sekvenser av 409 kreft relevante gener8. En fordel m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av den italienske kreft Genova Project (Grant no. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Grant no. 12182 til AS og 18178 til VC), FP7 European Community Grant (cam-PAC no 602783 til AS). Finansierings byråene hadde ingen rolle i innsamlingen, analysen og tolkningen av data eller i skrivingen av manuskriptet.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
Riferimenti
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
