Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida
Summary
Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.
Abstract
Evaluar la heterogeneidad intratumoral (ITH) es de suma importancia para anticipar el fracaso de las terapias dirigidas y diseñar estrategias antitumorales eficaces en consecuencia. Aunque con frecuencia se plantean preocupaciones debido a las diferencias en el procesamiento de muestras y la profundidad de la cobertura, la secuenciación de próxima generación de tumores sólidos ha desentrañado un grado muy variable de ITH entre los tipos de tumores. La captura de la relación genética entre las lesiones primarias y metastásicas mediante la identificación de poblaciones clonales y subclonales es fundamental para el diseño de terapias para enfermedades en estadio avanzado. Aquí, informamos de un método para el análisis comparativo de lesiones que permite la identificación de poblaciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes del mismo paciente. El enfoque experimental descrito aquí integra tres enfoques bien establecidos: análisis histológico, secuenciación multilesione de alta cobertura y análisis inmunofenotípicos. Con el fin de minimizar los efectos en la detección de eventos subclonales por procesamiento inapropiado de muestras, sometimos a los tejidos a un examen patológico cuidadoso y el enriquecimiento de células neoplásicas. El ADN controlado por calidad de lesiones neoplásicas y tejidos normales fue sometido a una secuenciación de alta cobertura, dirigida a las regiones codificantes de 409 genes cancerosos relevantes. Aunque sólo se examina un espacio genómico limitado, nuestro enfoque permite evaluar el grado de heterogeneidad entre las alteraciones somáticas (mutaciones de un solo nucleótido y variaciones de números de copia) en lesiones distintas de un paciente determinado. A través del análisis comparativo de los datos de secuenciación, pudimos distinguir las alteraciones clonales frente a las subclonales. La mayoría de la ITH a menudo se atribuye a mutaciones de pasajeros; por lo tanto, también utilizamos la inmunohistoquímica para predecir las consecuencias funcionales de las mutaciones. Si bien este protocolo se ha aplicado a un tipo de tumor específico, anticipamos que la metodología descrita aquí es ampliamente aplicable a otros tipos de tumores sólidos.
Introduction
El advenimiento de la secuenciación de próxima generación (NGS) ha revolucionado la forma en que se diagnostican y tratan los cánceres1. NGS acoplado a la secuenciación multirregional han expuesto un alto grado de heterogeneidad intratumoral (ITH) en tumores sólidos2, lo que explica en parte el fracaso de la terapia dirigida debido a la presencia de subclones con diferente sensibilidad a los fármacos2 . Un desafío importante planteado por los estudios de secuenciación del genoma es la necesidad de distinguir entre mutaciones de pasajeros (es decir, neutrales) y conductores en cánceres individuales3. En efecto, varios estudios han demostrado que, en determinados tumores, las mutaciones de los pasajeros representan la mayoría de la ITH, mientras que las alteraciones del conductor tienden a conservarse entre las lesiones del mismo individuo4. También es importante tener en cuenta que la gran carga mutacional (como se ve en los cánceres de pulmón y el melanoma) no implica necesariamente una gran carga mutacional subclonal2. Por lo tanto, se puede encontrar un alto grado de ITH en tumores con baja carga mutacional.
Las metástasis son responsables de más del 90% de la muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo5; por lo tanto, la captura de la heterogeneidad mutacional de los genes del conductor entre las lesiones primarias y metastásicas es fundamental para el diseño de terapias eficaces para enfermedades en estadio avanzado. La secuenciación clínica se realiza generalmente en ácidos nucleicos de tejidos fijos, lo que dificulta la exploración en todo el genoma debido a la mala calidad del ADN. Por otro lado, la intención de la secuenciación clínica es identificar mutaciones y/o mutaciones procesables que podrían predecir la capacidad de respuesta/falta de respuesta a un régimen terapéutico determinado. Tal como está, la secuenciación puede limitarse a una fracción menor del genoma para la extracción oportuna de información clínicamente relevante. La transición de la generación de perfiles de ADN de bajo rendimiento (por ejemplo, secuenciación de Sanger) a NGS ha hecho posible analizar cientos de genes relevantes para el cáncer a una alta profundidad de cobertura, lo que permite la detección de eventos subclonales. Aquí, informamos de un método para el análisis comparativo de lesiones que permite la identificación de poblaciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes del mismo individuo. El método descrito aquí integra tres enfoques bien establecidos (análisis histológico, secuenciación multilesional de alta cobertura y análisis inmunofenotípicos) para predecir las consecuencias funcionales de las variaciones identificadas. El enfoque se describe esquemáticamente en la Figura 1 y se ha aplicado al estudio de 5 casos metastásicos de neoplasias pseudopamizas sólidas (SPN) del páncreas. Si bien describimos el procesamiento y análisis de muestras de tejido sinovertina fijadas en formalina (FFPE), el mismo procedimiento se puede aplicar al material genético del tejido congelado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro método permite la identificación de alteraciones moleculares implicadas en la progresión de tumores sólidos a través de la integración de datos verticales (es decir, morfología, secuenciación de ADN e inmunohistoquímica) a partir de lesiones distintas de un paciente determinado. Demostramos la capacidad de nuestro método para detectar eventos clonales y subclonales en un tipo de tumor silencioso mutacional (es decir, SPN, neoplasia sólida-pseudopapilar del páncreas) interrogando las secuencias de codi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por el Proyecto Génova Del Cáncer Italiano (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Concesión No 12182 a AS y 18178 a VC), 77 Subvención de la Comunidad Europea (Cam-Pac No 602783 a AS). Los organismos de financiación no tuvieron ningún papel en la recopilación, análisis e interpretación de datos ni en la redacción del manuscrito.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
Riferimenti
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