Jämförande lesioner analys genom en riktad sekvensering strategi
Summary
Denna artikel beskriver en metod för att identifiera klonala och subklonala förändringar mellan olika prover från en given patient. Även om de experiment som beskrivs här fokuserar på en specifik tumörtyp, tillvägagångssättet är i stort sett tillämplig på andra solida tumörer.
Abstract
Att bedöma intra-tumoral heterogenitet (ITH) är av största vikt för att förutse misslyckande av riktade terapier och design därmed effektiva anti-tumör strategier. Även om oro ofta höjs på grund av skillnader i provbehandling och djup täckning, nästa generations sekvensering av solida tumörer har avslöjad en mycket varierande grad av ITH över tumörtyper. Att fånga den genetiska släktskap mellan primära och metastaserande lesioner genom identifiering av klonala och subklonala populationer är avgörande för utformningen av terapier för avancerade sjukdomar. Här rapporterar vi en metod för jämförande lesioner analys som möjliggör identifiering av klonala och subklonala populationer bland olika prover från samma patient. Den experimentella metoden som beskrivs här integrerar tre väl etablerade tillvägagångssätt: histologisk analys, hög täckning multi-lesion sekvensering, och immunophenotypic analyser. För att minimera effekterna på detektion av subklonala händelser genom olämplig provbehandling, vi utsätts vävnader för noggrann patologisk undersökning och neoplastiska cell berikning. Kvalitetskontrollerade DNA från neoplastiska lesioner och normala vävnader utsattes sedan för hög täckning sekvensering, inriktning på kodning regioner 409 relevanta cancergener. Samtidigt som man bara tittar på ett begränsat genomiskt utrymme, gör vårt tillvägagångssätt det möjligt att utvärdera omfattningen av heterogenitet mellan somatiska förändringar (single-nucleotide mutationer och kopior-nummer variationer) i distinkta lesioner från en given patient. Genom jämförande analys av sekvenserings data kunde vi urskilja klonala vs. subklonala förändringar. Majoriteten av ITH tillskrivs ofta passagerar mutationer; Därför använde vi också immunohistokemi för att förutsäga funktionella konsekvenser av mutationer. Även om detta protokoll har tillämpats på en viss tumörtyp, vi räknar med att den metod som beskrivs här är i stort sett tillämplig på andra solida tumörtyper.
Introduction
Tillkomsten av nästa generations sekvensering (NGS) har revolutionerat hur cancer diagnostiseras och behandlas1. NGS kopplat till multiregionala sekvensering har utsatt en hög grad av intratumoral heterogenitet (ITH) i solida tumörer2, vilket förklarar delvis misslyckandet med riktad behandling på grund av närvaron av subklonar med olika läkemedels känslighet2 . En viktig utmaning som orsakas av genomomfattande sekvenserings studier är nödvändigheten av att skilja mellan passagerare (dvs. neutrala) och förar mutationer i enskilda cancerformer3. Flera studier har verkligen visat att, i vissa tumörer, passagerar mutationer står för majoriteten av ITH, medan föraren förändringar tenderar att bevaras bland lesioner av samma individ4. Det är också viktigt att notera att stora mutationell börda (som kan ses i lungcancer och melanom) inte nödvändigtvis innebär en stor subklonala mutationell börda2. Därför, en hög grad av ITH kan hittas i tumörer med låg mutationell börda.
Metastaser är ansvariga för mer än 90% av cancerrelaterad död i hela världen5; Därför är det avgörande för utformningen av effektiva terapier för framskridna sjukdomar att fånga den mutationella heterogeniteten hos drivrutingener bland primära och metastaserande lesioner. Klinisk sekvensering utförs vanligtvis på nukleinsyror från fasta vävnader, vilket gör att genomomfattande prospektering är svår på grund av dålig DNA-kvalitet. Å andra sidan, avsikten med klinisk sekvensering är att identifiera angribara mutationer och/eller mutationer som kan förutsäga lyhördhet/oreaktionsförmåga till en given terapeutisk regim. I den mån det är, kan sekvensering begränsas till en mindre del av genomet för snabb extraktion av kliniskt relevant information. Övergången från DNA-profilering med låg kapacitet (t. ex. Sangersekvensering) till NGS har gjort det möjligt att analysera hundratals cancerrelevanta gener vid ett högt djup av täckning, vilket gör det möjligt att upptäcka subklonala händelser. Här rapporterar vi en metod för jämförande lesioner analys som möjliggör identifiering av klonala och subklonala populationer bland olika prover från samma individ. Den metod som beskrivs här integrerar tre väl etablerade metoder (histologisk analys, hög täckning multi-lesion sekvensering, och immunophenotypic analyser) för att förutsäga funktionella konsekvenser av de identifierade variationerna. Metoden beskrivs schematiskt i figur 1 och har tillämpats på studien av 5 metastatiska fall av solida pseudopapillära neoplasmer (SPN) i bukspottkörteln. Medan vi beskriver bearbetning och analys av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnadsprov, samma förfarande kan tillämpas på genetiskt material från färsk-fryst vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår metod möjliggör identifiering av molekylära förändringar involverade i progression av solida tumörer genom integration av vertikala data (dvs., morfologi, DNA-sekvensering, och immunohistokemi) från distinkta lesioner av en given patient. Vi visade förmåga att vår metod för att upptäcka klonala och subklonala händelser i en Mutations Silent tumörtyp (dvs., SPN, solid-pseudopapillary tumör i i bukspottkörteln) genom förhör kodnings sekvenser av 409 cancer relevanta gener8. En…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av det italienska cancer arvs projektet (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana ricerca Cancro (AIRC; Grant nr 12182 till AS och 18178 till VC), FP7 Europeiska gemenskapens bidrag (Cam-PAC nr 602783 till AS). Finansieringsorganen hade ingen roll i insamlingen, analysen och tolkningen av uppgifterna eller i manuskriptet.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
Riferimenti
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
