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Neuroscienze

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Published: October 16, 2019
doi:
10.3791/59859
,
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science,RIKEN, 2Senior Adviser’s Office, Center for Brain Science,RIKEN

Summary

Bei einigen genmanipulierten Tieren kann die Verwendung eines einzigen Protokolls nicht in zerebellar Purkinje-Zellen ltd induzieren, und es kann eine Diskrepanz zwischen LTD und motorischem Lernen geben. Mehrere Protokolle sind notwendig, um die LTD-Induktion bei genmanipulierten Tieren zu bewerten. Standardprotokolle werden angezeigt.

Abstract

Synaptische Plastizität bietet einen Mechanismus zum Lernen und Gedächtnis. Für das kleinhirnmotorische Lernen gilt die Langzeitdepression (LTD) synaptischer Übertragungen von Parallelfasern (PF) zu Purkinje-Zellen (PC) als Grundlage für motorisches Lernen, und Mängel sowohl des LTD- als auch des motorischen Lernens werden in verschiedenen genmanipulierten Tieren. Gemeinsame motorische Lernsets, wie die Anpassung des optokinetischen Reflexes (OKR), der vestiular-okuläre Reflex (VOR) und der Rotarod-Test wurden zur Beurteilung der motorischen Lernfähigkeit verwendet. Die Ergebnisse der GluA2-carboxy Endstation modifizierten Einschlagsmäuse zeigten jedoch eine normale Anpassung des VOR und des OKR, obwohl PF-LTD fehlte. In diesem Bericht wurde die Induktion von LTD nur mit einer Art Stimulationsprotokoll bei Raumtemperatur versucht. So wurden Bedingungen zur Induzieren von Kleinhirn-LTD in den gleichen Einschlagsmutanten mit verschiedenen Protokollen bei nahezu physiologischer Temperatur untersucht. Schließlich fanden wir Stimulationsprotokolle, mit denen LTD bei diesen genmanipulierten Mäusen induziert werden konnte. In dieser Studie wird eine Reihe von Protokollen zur Bewertung der LTD-Induktion vorgeschlagen, die eine genauere Untersuchung des kausalen Zusammenhangs zwischen LTD und motorischem Lernen ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass experimentelle Bedingungen bei der Bewertung von LTD bei genmanipulierten Mäusen von entscheidender Bedeutung sind.

Introduction

Die synaptische Organisation der ausgeklügelten neuronalen Netzwerke des Kleinhirnkortex, bestehend aus PCs, molekularen Schicht-Interneuronen (Korb- und Stellatzellen), Golgi-Zellen, PFs aus Granulatzellen, Moosfasern und Kletterfasern (CFs), wurden aufgeklärt in Bezug auf Erregung/Hemmung und Divergenz/Konvergenz, und das gut organisierte Schaltplan diagramm hat vorgeschlagen, dass das Kleinhirn eine “neuronale Maschine”ist 1, obwohl es vorher keine Ahnung über den Zweck dieser “Maschine” gab. Später schlug Marr vor, dass die PFs-Eingabe in PCs ein dreischichtiges assoziatives Lernnetzwerk2bilden sollte. Er schlug auch vor, dass jeder CF eine zerebrale Anweisung für Elementarbewegung2vermittelt. Er ging davon aus, dass die gleichzeitige Aktivierung von PFs und CF die PF-PC-Synapsenaktivität verbessern und eine langfristige Potenzierung (LTP) der PF-PC-Synapse verursachen würde. Andererseits ging Albus davon aus, dass die synchrone Aktivierung von PFs und CF zu LTD an den PF-PC Synapsen3führte. Beide oben genannten Studien interpretieren das Kleinhirn als einzigartiges Speichergerät, dessen Einbindung in das kleinhirnförmige kortikale Netzwerk zur Bildung des Marr-Albus-Modelllernmaschinenmodells führt.

Nach diesen theoretischen Vorhersagen deuten zwei Beweislinien auf das Vorhandensein synaptischer Plastizität im Kleinhirn hin. Die erste Beweislinie wurde von der anatomischen Organisation des Flocculus vorgeschlagen; hier konvergieren MF-Wege vestibulären Organursprungs und CF-Wege retinalen Ursprungs auf den PCs4. Dieses einzigartige Konvergenzmuster legt nahe, dass eine synaptische Plastizität, die im Flocculus auftritt, die bemerkenswerte Anpassungsfähigkeit des vestibulo-okulären Reflexes verursacht. Zweitens stützten die Aufzeichnung der PCs-Antwort im Flocculus und die Läsion des Flocculus auch die obige Hypothese5,6,7. Darüber hinausstützte das PC-Entladungsmuster während der Anpassung der Handbewegung 8 eines Affen die synaptische Plastizitätshypothese, insbesondere Albus’ LTD-Hypothese3.

Um die Art der synaptischen Plastizität direkt zu bestimmen, wurde gezeigt, dass die wiederholte Konjunktivstimulation (Cjs) eines Bündels von PFs und des CF, das den PC in vivo spezifisch innerviert, LTD für die Transmissionswirksamkeit der PF-PC-Synapsen9induzierte. 10,11. In den anschließenden In-vitro-Explorationen mit einem Kleinhirnschnitt12 und kultivierten PCs, Konjunktion von kokultivierter Granulatzellstimulation und Olivzellenstimulation13 oder Konjunktion iontophoretisch angewendeter Glutamat- und somatisch Depolarisation14,15 verursacht LTD. Der der LTD-Induktion zugrunde liegende Signaltransduktionsmechanismus wurde ebenfalls intensiv mit In-vitro-Präparaten16,17untersucht.

Anpassungen des VOR und des OKR wurden häufig zur quantitativen Bewertung von Genmanipulationseffekten auf das kleinhirnmotorische Lernen verwendet, da sich der vestibule-zerebellare Kortex als wesentlicher Ursprung beim adaptiven Lernen des VOR18 erwiesen hat. ,19,20 und die OKR19,21 Die Korrelation zwischen Versagen der LTD-Induktion und Beeinträchtigung des verhaltensmotorischen Lernens wurde als Beweis dafür genommen, dass LTD eine wesentliche Rolle bei der Lernmechanismen22. Diese Ansichten werden kollektiv als die LTD-Hypothese des motorischen Lernens oder Marr-Albus-Ito-Hypothese23,24,25,26bezeichnet.

Adaptives Lernen der Augenbewegung wurde mit ähnlichen Protokollen gemessen, während verschiedene experimentelle Bedingungen verwendet wurden, um LTD in der Scheibenvorbereitung27,28,29,30,31 zu induzieren. . Kürzlich berichteten Schonewille et al.26, dass einige genmanipulierte Mäuse normales motorisches Lernen zeigten, aber die Kleinhirnscheiben zeigten keine LTD und kamen so zu dem Schluss, dass LTD für das motorische Lernen nicht wesentlich sei. Die Induktion von LTD wurde jedoch nur mit einer Art von Protokoll bei Raumtemperatur versucht. Daher verwendeten wir verschiedene Arten von LTD-induzierenden Protokollen unter Aufzeichnungsbedingungen bei etwa 30 °C, und wir bestätigten, dass die LTD zuverlässig in den genmanipulierten Mäusen induziert wurde, indem diese Protokolle bei nahe physiologischen Temperaturen32verwendet wurden.

Es bleiben jedoch einige Fragen zu den grundlegenden Eigenschaften der konjunktiven Stimulation. Die erste ist die Beziehung zwischen der Form der komplexen Spitze und der Amplitude von LTD. Zweitens war in Verbindung mit PF-Stimulation und somatischer Depolarisation, ob die Anzahl der eingesetzten Reize notwendig war oder nicht, schwer zu fassen war. In der vorliegenden Studie wurden diese Fragen mit Wildtyp-Mäusen (WT) untersucht.

Protocol

Alle Versuchsverfahren wurden vom RIKEN-Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Tieren in Experimenten genehmigt. Mäuse wurden in der Tieranlage des RIKEN Center for Brain Science unter gut kontrollierter Temperatur (23–25 °C) und Feuchtigkeit (45%–65%) gehalten. Bedingungen. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche WT-Mäuse (C57BL/6, 3–6 Monate) verwendet. 1. Vorbereitung von Lösungen, die in den Experimenten verwendet werden HINWEIS:</st…

Representative Results

Vier Protokolle wurden in dieser Studie verwendet, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. In den ersten beiden Protokollen (Protokoll 1 und 2) wurde die Konjunktion der PF-Stimulation und der CF-Stimulation unter stromlastigen Bedingungen angewendet. In den beiden anderen Protokollen (Protokoll 3 und 4) wurde die somatische Depolarisation durch die CF-Stimulation unter Spannungsklemme ersetzt. Spannungsspuren oder Stromspuren bei der Konjunktivstimulation wurden verglichen (Abbildung 2). <p cla…

Discussion

Unterschiede zwischen den vier Protokollen

In den LTD-induzierenden Protokollen 1 und 2 reicht Cjs 300 mal bei 1 Hz aus, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. Die Stimulationshäufigkeit des CF schien sich in einem physiologischen Bereich zu befinden, da die komplexe Spike-Feuerrate bei alarmierten erwachsenen Mäusen (P60) 1,25 Hz36betrug. Die CF-Stimulation allein verursachte jedoch keine langfristige Plastizität in der PF-CF-Synapse, wie sie in den Protokollen 1 und 2 (<str…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken A. Oba für ihre technische Hilfe. Diese Forschung wurde teilweise durch Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 an K.Y. unterstützt.

Materials

Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).
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