Summary

从人类唾液腺中分离唾液表皮细胞,作为脂质层或单层体进行体外生长

Published: July 15, 2019
doi:

Summary

我们提出了一种分离和培养人类原发性唾液腺衍生上皮细胞的方法。这些细胞表现出与唾液上皮起源一致的基因表达模式,可以在从恩格尔布雷斯-霍尔姆-肖温肿瘤细胞中提取的基底膜基质上作为盐层生长,或作为治疗培养皿上的单层细胞生长。

Abstract

唾液腺是对人类疾病多方面感兴趣的研究人员非常感兴趣的场所。研究人员的目标之一是恢复因放射治疗或与Sjögren综合征相关的病理而受损的腺体的功能。研究人员的第二个目标是确定病毒在腺组织内复制的机制,然后它们能够获得对水平传播至关重要的唾液。这些目标突出表明,需要一种强大且易于获取的体外唾液腺模型,供对上述相关研究领域感兴趣的研究人员使用。在这里,我们讨论一个简单的协议,从人类唾液腺分离上皮细胞,并在体外繁殖它们。我们的协议可以进一步优化,以满足个别研究的需要。简单地说,唾液组织是机械和酶分离,以分离单个细胞或小簇细胞。上皮细胞的选择是在存在经过优化以促进上皮细胞生长的介质的情况下,电镀到基底膜基质上。这些生成的培养物可以作为三维簇,称为”盐层”,或作为经处理的塑料组织培养皿的单层生长。该协议导致主要上皮细胞的异质种群的生长,在接受细胞衰老之前,可以繁殖5-8个通道(15-20个种群翻倍)。

Introduction

在哺乳动物中,唾液腺被组织成3对主要的唾液腺:小黄体、亚黄土和亚语言腺。也有一系列小腺位于舌头上,分散在整个口腔1。主要腺体负责产生的唾液的体积2。除了通过分泌因子提供抗菌保护外,唾液在咀嚼和润滑食物的过程中也非常重要,因为它通过食道2。因此,唾液腺功能障碍是一个医疗问题,患者谁不能产生足够的唾液更容易发展疾病,如蛀牙或口腔念珠菌病3。此外,唾液减少会导致饮食和消化食物更加困难,对生活质量有显著影响。

唾液腺功能障碍主要发生在患有Sjögren综合征(一种自身免疫性疾病)的患者中,或在接受辐照治疗3、4、5的头部和颈部癌症患者中。 6.由于自身免疫或放射治疗,腺体内受损的分泌性腺体不进行自我更新,导致患者生活在不可逆转的损害6。唾液腺的研究也引起了人们对病毒发病机制的关注或研究人员的关注。一些病原体,如人类巨细胞病毒(HCMV),在唾液腺内持续复制,然后允许通过唾液7、8将新生病毒传染给新的宿主。因此,开发健壮且可重复的唾液腺组织体外模型,以解决和理解各种医疗问题,是未满足的需求。

几个模型的鼠唾腺系统已被用作一个起点,了解和表征不同的上皮细胞,形成唾液腺9,10。人与鼠唾液腺11之间存在明显和重大的差异。最值得注意的是,人类的副体腺体相对于亚曼地腺体较大,而小鼠的亚曼底和花环在大小1、2、11上非常相似。虽然存在不朽的人类亚曼地状细胞系,但人们主要担心永生细胞不能准确维持主要组织的表型,二者担心永生细胞实际上并非来自唾液上皮本身12。由于这些原因,人们有兴趣和需要研究人类的主要唾液组织。

Protocol

辛辛那提大学机构审查委员会(联邦范围的保障#00003152,IRB 协议 2016-4183) 对这些协议和研究进行了审查和批准。唾液组织通常在许多头部和颈部手术中被切除,并且通常不参与恶性过程。通常,从患者中取出后2-4小时内使用新切除的唾液腺组织(图1A)。 1. 试剂制备 支气管上皮细胞生长培养基 (BEGM) 从制造商提供的套件中添加组件(?…

Representative Results

在将细胞从消化组织电镀到BMM后两三天,细胞将很容易形成小簇,每个簇的大小将继续扩大至15-20个细胞(图2A)。通常可以看到细胞碎片和分离的死细胞,应通过吸气和补充新鲜介质来清除。细胞将继续增殖为盐层约3-10天,或只要BMM层保持完整。有时,由于BMM的部分分解,细胞将附着在底层塑料上,并开始增殖为单层。生长在BMM上的盐层在尺寸和结构复杂性方?…

Discussion

唾液功能障碍代表了对Sjögren综合征患者以及接受唾液腺3、4、5附近癌症放射治疗的人的生活质量的关注。 16.治疗这些病人的一种建议疗法是在体外生长功能性唾液干细胞或器官,然后可以插入受损的唾液腺,以取代受影响的组织9。此外,唾液腺通常是人类病原体的持久性和传播的场所…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们要感谢詹姆斯·布里奇斯就培养原细胞的方法提供了重要指导。Matthew J. Beucler 得到了国家卫生训练学院 T32-ES007250 的支持。这项工作还得到了国家卫生研究院授予威廉·米勒的R01-AI121028和R21-DE026267的资助。

Materials

100 mm culture dishes Thermo Scientific 172931
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339651
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media Lonza CC-3171 Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh Fisher 22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum Gibco 12676-029
Collagenase type III Worthington LS004182 Store at 4 °C.
Cryogenic Tube Fisher 5000-0020
Dispase Cell Applications 07923 Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors Fisher 08-940
Dulbecco phosphate buffered saline Corning 55-031-PC
General Chemicals Sigma
PathClear Basement membrane extract Cultrex 3432-005-01 Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes Falcon 353046
Surgical forceps Fisher 22-079-742
Trypsin-EDTA solution Corning 25-052-CI

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Citazione di questo articolo
Beucler, M. J., Miller, W. E. Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers. J. Vis. Exp. (149), e59868, doi:10.3791/59868 (2019).

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