Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

Summary

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) loin des virions à haut rendement et à haut rendement en incorporant les précipitations EV, l’ultracentrifugation du gradient de densité et la capture des particules pour permettre un flux de travail rationalisé et une réduction du démarrage volumes, ce qui entraîne des préparations reproductibles pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques.

Abstract

L’un des principaux obstacles dans le domaine de la recherche sur la vésicule extracellulaire (VE) aujourd’hui est la capacité d’atteindre des préparations év.s.rpure dans un environnement d’infection virale. La méthode présentée vise à isoler les véhicules électriques loin des virions (c.-à-d. le VIH-1), ce qui permet une efficacité et un rendement plus élevés par rapport aux méthodes conventionnelles d’ultracentrifugation. Notre protocole contient trois étapes : précipitation sev, séparation du gradient de densité et capture des particules. Les essais en aval (c.-à-d. western blot et PCR) peuvent être exécutés directement après la capture des particules. Cette méthode est avantageuse par rapport à d’autres méthodes d’isolement (c.-à-d. ultracentrifugation) car elle permet l’utilisation de volumes de départ minimes. En outre, il est plus convivial que les méthodes alternatives d’isolation EV nécessitant plusieurs étapes d’ultracentrifugation. Cependant, la méthode présentée est limitée dans sa portée d’essais fonctionnels EV car il est difficile d’éluter les véhicules électriques intacts de nos particules. En outre, cette méthode est adaptée à un cadre strictement fondé sur la recherche et ne serait pas commercialement viable.

Introduction

La recherche centrée sur les vésicules extracellulaires (VE), en particulier les exosomes, un type de VE allant de 30 à 120 nm et caractérisée par la présence de trois marqueurs de tétraspaninCD81, CD9 et CD63, a été en grande partie façonnée par le développement de méthodes d’isolement et de purifier les vésicules d’intérêt. La capacité de disséquer les mécanismes multiformes a été entravée en raison de techniques complexes et chronophages qui génèrent des échantillons composés d’une population hétérogène de vésicules générées par différentes voies avec un large éventail de contenus, tailles, et Densités. Bien qu’il s’agisse d’un problème pour presque toutes les recherches sur les véhicules électriques, il est particulièrement important lorsqu’il s’agit d’étudier les véhicules électriques dans le contexte de l’infection virale, car les virions et les particules virales (VLP) peuvent avoir un diamètre similaire aux vésicules d’intérêt. Par exemple, le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) mesure environ 100 nm de diamètre, ce qui est à peu près la même taille que de nombreux types de véhicules électriques. Pour cette raison, nous avons conçu un nouveau flux de travail d’isolement EV pour résoudre ces problèmes.

L’étalon-or actuel de l’isolement EV est l’ultracentrifugation. Cette technique utilise les différentes densités vésicules, ce qui permet aux vésicules d’être séparées par centrifugation avec sédimentation différentielle de particules de densité plus élevée par rapport aux particules de densité inférieure à chaque étape ^1,2. Plusieurs étapes de centrifugation à basse vitesse sont nécessaires pour enlever les cellules intactes (300-400 x g pendant 10 min), les débris cellulaires (2 000 x g pour 10 min) et les corps apoptotiques/grandes vésicules (10 000 x g pendant 10 min). Ces purifications initiales sont suivies d’une ultracentrifugation à grande vitesse (100 000 à 200 000 x g pour 1,5 à 2 h) vers les véhicules électriques sédimentaires. Des étapes de lavage sont effectuées pour assurer davantage la pureté de EV, cependant, ceci a comme conséquence la réduction du nombre d’EV isolés, abaissant de ce fait le rendement total ^3,4. L’utilité de cette méthode est encore limitée par l’exigence d’un grand nombre de cellules (environ 1 x 10⁸) et d’un grand volume d’échantillon (-gt; 100 ml) pour obtenir des résultats adéquats.

Pour répondre aux préoccupations croissantes, la précipitation de vésicules avec des polymères hydrophiles est devenue une technique utile ces dernières années. Le polyéthylène glycol (PEG), ou d’autres réactifs de précipitation séquencés connexes, permet à l’utilisateur de démonter les vésicules, les virus et les agrégats de protéines ou d’ARN protéiques dans un échantillon en couvainant simplement l’échantillon avec le réactif de choix, suivi d’une seule vitesse basse centrifugation^1,2,5. Nous avons précédemment signalé que l’utilisation de PEG ou de méthodes connexes pour précipiter les véhicules électriques par rapport à l’ultracentrifugation traditionnelle entraîne un rendement significativement plus élevé⁶. Cette stratégie est rapide, facile, ne nécessite pas d’équipement supplémentaire coûteux, est facilement évolutive, et conserve la structure EV. Cependant, en raison de la nature promiscuité de cette méthode, les échantillons résultants contiennent une variété de produits comprenant des protéines libres, des complexes de protéine, une gamme de véhicules électriques, et des virions nécessitant ainsi une purification supplémentaire pour obtenir la population désirée^{1 ,2,7,8}.

Pour surmonter l’hétérogénéité des véhicules électriques obtenus à partir de diverses méthodes de précipitation, l’ultracentrifugation du gradient de densité (DG) est utilisée pour mieux séparer les particules en fonction de leur densité. Cette méthode est réalisée à l’aide d’un gradient stepwise à l’aide d’un milieu de gradient de densité, comme l’iodixanol ou le saccharose, qui permet la séparation des véhicules électriques des protéines, des complexes protéiques et des particules virales ou virales (VLP). Il est important de noter que, bien qu’on ait pensé autrefois que la DG permettait une séparation plus précise des sous-populations de veaux, on sait maintenant que les tailles et les densités de diverses vésicules peuvent se chevaucher. Par exemple, on sait que les exosomes ont des densités de flottaison de 1,08-1,22 g/mL⁹, tandis que les vésicules isolées du Golgi (COPI^ou clathrine) ont des densités de 1,05-1,12 g/mL et celles du reticu(COPII) ) sédiments à 1,18-1,25 g/mL^1,2,3,4,9. En outre, si l’on désire comparer les fractions exosomal avec les fractions contenant des particules virales, cela peut devenir plus difficile en fonction de la densité du virus d’intérêt , il existe des virus autres que le VIH-1 qui sont probablement en équilibre densités comme fractions positives exosomales².

Enfin, l’enrichissement des préparations EV pour la visualisation en aval et les essais fonctionnels est essentiel à la recherche sur les véhicules électriques. L’utilisation de nanoparticules enrichies de véhicules électriques, en particulier de particules hydrogel multifonctionnelles de 700 à 800 nm de diamètre, constituent une étape cruciale dans la réalisation de préparations concentrées pour les véhicules électriques. Ils possèdent un appât aromatique à haute affinité qui est encapsulé par une coquille de tamisage externe poreuse pour favoriser la sélectivité. Les nanoparticules utilisées dans cette étude comprennent deux préparations distinctes avec des appâts de base différents (Réactive Red 120 NT80; et Cibacron Blue F3GA NT82) qui ont montré qu’elles augmentaient la capture des véhicules électriques à partir de divers réactifs et biofluides (voir le Tableau des matériaux )^{6,10,11,12,13,14,15}. Les particules offrent l’enrichissement facile des véhicules électriques à partir de nombreux matériaux de départ, y compris les fractions d’iodixanol, supernatant de culture cellulaire, ainsi que les biofluides patients tels que le plasma, le sérum, les fluides rachidiens (CSF), et l’urine^6,13 .

La méthode présentée ici améliore l’efficacité des techniques actuelles de purification des véhicules électriques en combinant plusieurs technologies; Précipitation synveux, ultracentrifugation du gradient de densité et captage des particules, afin de rationaliser le flux de travail, de réduire les besoins en échantillons et d’augmenter le rendement afin d’obtenir un échantillon de VE plus homogène pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques. Cette méthode est particulièrement utile dans l’étude des véhicules électriques et de leur contenu pendant l’infection virale, car elle comprend une étape de filtration de 0,22 m pour exclure les vésicules et les VLP de grande taille et indésirables et la séparation de la population totale de véhicules électriques en fonction de la densité afin d’en faire efficacement isoler les véhicules électriques des virions.

Protocol

1. Filtration et précipitation des vésicules extracellulaires (VEV) Pour préparer le supernatant de culture à partir de cellules infectées ou transfectées (c.-à-d. lignées cellulaires et/ou cellules primaires), la culture d’environ 10 ml de cellules de bois tardif pendant 5 jours à 37 oC et de 5 % de CO2 dans un milieu de culture approprié (c.-à-d. RPMI ou DMEM avec 10 % de bovins foetaux sérum [FBS]).REMARQUE: Tous les réactifs moyens de culture doivent être exempt…

Representative Results

Les précipitations PEG augmentent le rendement des véhicules électriquesNotre approche combinée à l’isolement EV est significativement plus efficace en termes de récupération EV par rapport à l’ultracentrifugation traditionnelle, comme en témoigne la réduction de 90% du volume de matériel de départ requis. L’ultracentrifugation, l’étalon-or actuel dans l’isolement des véhicules électriques, nécessite environ 100 ml de supernatant de culture pour produi…

Discussion

La méthode décrite permet d’améliorer le rendement des véhicules électriques et la séparation du virus des véhicules électriques en utilisant une approche combinée de l’isolement. Des quantités relativement importantes de matériau de départ (c.-à-d. supernatant cellulaire) peuvent être filtrées avant l’isolement des véhicules électriques par les précipitations, la séparation de la DG et l’enrichissement par nanoparticules, ce qui donne un volume final de 30 l, ce qui permet une utilisation immédiate d…

Materials

CEM CD4+ Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS without Ca and Mg (1X)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Peak Serum	PS-FB3	Serum
HIV-1 infected U937 Cells	NIH AIDS Reagent Program	165	U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
Ultra-Clear Tube, 14x89mm	Beckman Coulter	344059