高产细胞外囊泡制剂的纯化远离病毒

Summary

该协议通过结合EV沉淀、密度梯度超离和颗粒捕获，将细胞外囊泡（EV）与高效和屈服的病毒分离，从而简化工作流程和减少启动体积要求，导致可重复的制剂用于所有EV研究。

Abstract

当今细胞外囊泡 （EV） 研究领域的主要障碍之一是在病毒感染环境中实现纯化 EV 制剂的能力。提出的方法旨在将EV与病毒分离（即HIV-1），与传统的超离心方法相比，具有更高的效率和产量。我们的协议包含三个步骤：EV沉淀、密度梯度分离和粒子捕获。下游测定（即西斑点和PCR）可以直接在颗粒捕获后运行。此方法比其他隔离方法（即超离心）更有利，因为它允许使用最小起始体积。此外，它比需要多个超离心步骤的替代 EV 隔离方法更便于用户使用。然而，由于很难从粒子中洗去完整的EV，因此所呈现的方法在功能EV测定的范围上受到限制。此外，这种方法是针对严格的基于研究的设定，在商业上不可行。

Introduction

研究围绕细胞外囊泡 （EV）， 特别是外显体， 一种 EV 范围 30-120 nm ， 其特点是存在三个四边形标记 CD81， CD9 和 CD63， 在很大程度上已经形成的方法， 分离和净化感兴趣的囊泡。解剖多层面机制的能力受到阻碍，因为复杂的和耗时的技术，生成样本组成由异质的囊泡群产生，通过不同的途径产生，内容广泛，大小，和密度。虽然这是几乎所有EV研究的问题，但在在病毒感染环境中研究EV时，它特别重要，因为病毒和病毒样颗粒（VLP）的直径可以与感兴趣的囊泡相似。例如，人类免疫缺陷病毒类型1（HIV-1）的直径约为100纳米，与许多类型的EV大致相同。因此，我们设计了一种新的 EV 隔离工作流来解决这些问题。

目前EV隔离的黄金标准是超离心。该技术利用各种囊泡密度，允许囊泡分离离心与差异沉积的高密度粒子与低密度粒子在每个^{阶段1，2。}需要几个低速离心步骤来去除完整的细胞（300-400 x g 10 分钟）、细胞碎片（±2，000 x g 10 分钟）和凋亡体/大囊泡（10 分钟=10，000 x g）。这些初始纯化后，高速超离心（100，000-2000，000 x g，1.5-2 小时）到沉积物EV。 执行洗涤步骤以进一步确保 EV 纯度，但是，这会导致隔离 EV 的数量减少，从而降低总产量^3，4。此方法的效用进一步受到需要大量单元（约 1 x 10^8）和大样本体积 （> 100 mL） 以达到足够的结果的限制。

为了解决人们日益关注的问题，近年来，用亲水性聚合物沉淀囊泡已成为一种有用的技术。聚乙烯乙二醇 （PEG） 或其他相关的沉淀试剂允许用户通过使用选择的试剂孵育样品，然后以单个低速孵育样品，提取样品中的囊泡、病毒和蛋白质或蛋白质-RNA聚合体离心^1，2，5。我们以前曾报道过，使用PEG或相关方法沉淀EV与传统超离心相比，可产生更高的^产量6。此策略快速、简单，不需要额外的昂贵设备，易于扩展，并保留了 EV 结构。然而，由于这种方法的混杂性，所得样品含有多种产品，包括游自由蛋白、蛋白质复合物、一系列EV和病毒，因此需要进一步纯化才能获得所需的^{种群1。 ，2，7，8}.

为了克服从各种沉淀方法中获得的EV的异质性，利用密度梯度超离心（DG）来更好地根据粒子的密度分离粒子。此方法使用密度梯度介质（如碘醇或蔗糖）进行逐步梯度，允许将 EV 与蛋白质、蛋白质复合体以及病毒或病毒样颗粒 （VLP） 分离。需要注意的是，虽然人们曾经认为DG允许更精确地分离EV亚群，但现在人们知道，各种囊泡的大小和密度可以重叠。例如，已知外体具有1.08-1.22 g/mL⁹的浮选密度，而从Golgi（COPI⁺或克拉林^*）分离的囊泡的密度为1.05-1.12 g/mL，而来自内质的色囊密度（COPII⁼） 沉积物在 1.18-1.25 g/mL^{1，2，3，4，9}.此外，如果希望将外索分数与含有病毒颗粒的馏分进行比较，这可能变得更加困难，具体取决于感兴趣的病毒的密度 – 除了HIV-1之外，还有其他病毒可能同时均衡密度作为外体正^分数2。

最后，富集用于下游可视化和功能测定的EV制备对EV研究至关重要。使用EV富集纳米颗粒，特别是直径为700-800nm的多功能水凝胶颗粒，是实现集中式EV制备的关键步骤。它们具有高亲和力芳香诱饵，由多孔外筛壳封装，以促进选择性。本研究中使用的纳米粒子包括两种不同核心诱饵的显性制剂（反应红120 NT80;和Cibacron蓝色F3GA NT82），它们表明可以增加从各种试剂和生物流体中捕获EV（参见材料表））^{6，10，11，12，13，14，15}。这些颗粒从多种起始材料（包括碘化醇馏分、细胞培养上清液以及患者生物流体（如血浆、血清、脑脊髓液 （CSF）和尿液^6、13）中轻松浓缩 EV.

本文介绍的方法结合多种技术，提高了现有EV纯化技术的效率;EV 沉淀、密度梯度超离心和颗粒捕获，可简化工作流程、降低样品要求并提高产量，以获得更均匀的 EV 样本，用于所有 EV 研究。该方法在病毒感染期间对EV及其含量的调查特别有用，因为它包括0.22 μm过滤步骤，以排除大、不需要的囊泡和VLP，并根据密度分离总EV人群，以有效将 EV 与病毒隔离开来。

Protocol

1. 细胞外囊泡（EV）的过滤和沉淀 为了从受感染或转染的细胞（即细胞系和/或原细胞）制备培养上清液，在37°C下培养约10 mL的晚日志细胞，在适当的培养培养基（即，RPMI或DMEM，胎儿牛）中培养5天，培养5%的CO2 血清 [FBS]）。注：所有培养介质试剂应不含EV，并可购买（见材料表），或由100，000 x g的血清超前离心在内部制备，90分钟。该协议已经?…

Representative Results

PEG 降水增加 EV 产量与传统超离心相比，我们的 EV 隔离组合方法在 EV 回收方面的效率要高得多，所需起始材料体积减少 90%就可见一斑。超中光是EV隔离的现行黄金标准，需要大约100 mL的培养上清液才能为下游检测提供充足的EV准备，而我们的新型协议只需要10 mL。通过使用 PEG EV 沉淀试剂，通过纳米跟踪分析 （NTA） 测量，可显著提高 EV 产量，从而实现这种…

Discussion

概述的方法允许提高EV产量，并使用联合方法分离病毒从EV中分离出来。相对大量的起始材料（即细胞上清液）可以通过沉淀、DG分离和纳米颗粒富集在EV分离前进行过滤，最终体积为±30 μL，可立即在各种下游测定。纳米粒子富集的使用至关重要，因为与传统超离心相比，这些EV富集纳米粒子已被证明能更有效地捕获囊泡，产生大于或等于1mL培养的囊泡量上清比10 mL的超离心培养上^清15…

Materials

CEM CD4+ Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS without Ca and Mg (1X)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Peak Serum	PS-FB3	Serum
HIV-1 infected U937 Cells	NIH AIDS Reagent Program	165	U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
Ultra-Clear Tube, 14x89mm	Beckman Coulter	344059