עבודה זו מתארת שיטה חזקה וישירה כדי לזהות ולכמת את האנדוקאנמיאיד 2-ארכאינול (2-AG) ב- C. אלגיה. תקן הניתוח האנליטי הינו מוכן ומשמש לקוונפיקציה של 2-AG על ידי איזונושא דילול וכרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרורינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS).
עבודה זו מציגה שיטה להכנת תקן אנליטי לניתוח 2-ארכאיקסיקסיל (2-AG) באיכות ובכמת של נוזלים כרומטוגרפיה-אלקטרולינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS). אנדוקנבינואידים נשמרים מתווכים השומנים המסדירים תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים. ב C. אלגיה, 2-AG נמצא בעלי תפקידים שונים, כולל אפנון של היווצרות דאואר ומטבוליזם הכולסטרול. דו ח זה מתאר שיטה להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של התקנים החיצוניים הדרושים לקוונפיקציה של 2-AG. ההליך לסינתזה של התקן הוא פשוט יכול להתבצע בכל מעבדה, ללא צורך מומחיות סינתזה אורגנית או ציוד מיוחד. בנוסף, מתוארת שינוי של השיטה של Folch לחלץ את התקן הדאומנטי מתרבות C. אלגיה . בסופו של דבר, שיטה כמותית ואנליטית לזהות 2-AG באמצעות isotopically יציבה התווית אנלוגי 1-AG-d5 מתואר, אשר מספק תוצאות אמינות לרוץ מהיר כרומאטוגרפי. הנוהל הוא שימושי עבור לימוד תפקידים מרובים של 2-AG ב C. אלגיה בעוד להיות ישימה למחקרים אחרים של מטבוליטים באורגניזמים שונים.
אנדוקאנבינואידים לווסת תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים הם שמרו מגשרים השומנים1. הגילוי הראשון והטוב ביותר המאופיין באנדוקאנבינואידים הם אנאנדאמיד (ארכאדונאוליטהלתנולאמיד, איה) ו-2-ארכאיקסיקסיל גליצרול (2-AG). אנדוקאנבינואידים לשחק תפקידים קריטיים רבים, כולל אלה המעורבים במערכות תגמול המוח, כמו גם התמכרות לסמים, זיכרון, מצב רוח, ותהליכים מטבוליים2. איה ו-2-AG הם רק מסונתז בעת הצורך ויש להם חיים קצרים משתרע, והם מושפל דרך חלבון התחבורה ספיגה חוזרת הידרוליזה3.
השימוש במודלים של בעלי חיים כמו האלמרנים (C. אלגיה) הפך חשוב ללמוד את המגוון הגדול של תהליכים ביולוגיים כולל אפופטוזיס, איתות תא, מחזור התא, קוטביות התא, תקנה גנים, חילוף חומרים, הזדקנות, וקביעת מין4,5. בנוסף, הג הוא מודל מצוין לחקר התפקידים הפיזיולוגיים של חומצות שומן רב בלתי רוויות (pufas). איה זוהתה ב -C. אלגיה ומצטמצמת תחת הגבלת תזונה6. מחסור זה מרחיב את תוחלת החיים של נמטודות באמצעות מנגנון הגבלה תזונתיים שניתן לדכא על ידי תוספת עם אנדוקאנביאיד. לאחרונה, נתגלה כי 2-AG ו-איה משחקים תפקידים בסיסיים בוויסות סחר בכולסטרול בג7. חשוב מכך, נקבע כי התוספת עם אקסוגני 2-AG יכול להציל את מעצר דאואר, אשר נגרמת על ידי סחר הכולסטרול לקוי של נימן לבחור סוג C1 C. אלגיה מוטציות.
כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי 2-AG עם סחר בכולסטרול ותהליכים ביולוגיים אחרים ב נמטודות (כלומר, איתות monoaminergic, נוקטונזיה ו תנועה), זה חיוני לחקור את המטסוגזה אנדודוגלי ואיך זה מושפע בתנאים סביבתיים ותזונתיים מסוימים8,9,10,11,12,13. לכן, זה הכרחי לעצב ולמטב את השיטה כדי לזהות ולכמת אנדוגני 2-AG ב C. אלגיה כי הוא פשוט לשימוש עבור מדענים של שדות שונים, במיוחד אלה הלומדים את התנהגותו של nematode ביחס זה . בסדר, אנדוקנביאיד
בשנת 2008, לטונטן ועמיתים לעבודה הצליחו לזהות 2-AG ו -“איה” ב-C. אלגיה באמצעות שיטות אנליטיות LC-MS14. ב 2011, הם הצליחו להרחיב את הטכניקה הזאת לאנדוקנבינואידים אחרים15. העבודה האחרונה הראתה שיטות אנליטיות אחרות אשר הצליחו באיתור וכימות אנדוקנבינואידים ב -C. אלגיה, כולל ספקטרומטר מסה ו-GC-MS16,17,18, והוא חייב דווח גם כי ניתן להרחיב שיטות אנליטיות דומות למודלים אחרים19.
בעבר דיווחו שיטות אנליטיות המשמשות לכימות 2-AG בדגימות ביולוגיות כוללות בדרך כלל את השימוש בתקנים דאוטים הנרכשים מסחרית ודורשים זמינות לרכישה20,21. סטנדרטים אנליטיים רבים עבור כימות LC-MS/MS של אנדוקאנבינואידים הם זמינים מסחרית מספקים שונים. עם זאת, הם יקרים, רגישים, ולהיות תחמוצת לאורך זמן, עקב נוכחות של איגרות חוב כפולות מרובות. הגרסאות השכיחות ביותר של תקנים אלה מבוססים על החומצה הארכידונית של octa-שניוני ומתאימות לקוונפיקציה על ידי דילול האיזוטופ LC-ms/ms14,22. כמו כן, רוב הסטנדרטים הללו מוחלף במיקום 2 של גליצרול, מה שהופך אותם לא יציבים ברוב התנאים מאז הם נוטים הגירה acyl19,23.
כדי להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של הסטנדרטים הללו, שיטה נוחה ופשוטה מוצגת להכנת תקן אנליטי המבוסס על גליצרול-d5. הרצף שמטרתו להכין את התקן המחומש מחייב הליך שלושה שלבים התוצאתו תקן 1-AG-d5, אשר יציב ואינו עובר הגירה acyl (הבעיה העיקרית כאשר מכוון לסנתז 2-monoacylglycerols).
המטרה העיקרית כאן היא להראות שיטה פשוטה ומנויית ללמוד 2-AG ב -C. אלגיה, כולל סינתזה של תקן הניתוח האנליטי, ההכנה והחילוץ של דגימות נמטודות, וניתוח על ידי LC-ms/MS (איור 1 ). הליך סינתטי זה הוא השגה ללא הידע סינתזה אורגני מתוחכם או ציוד מיוחד, מה שהופך אותו מתאים למדענים מתחומים שונים אשר לומדים את ההתנהגות C. אלגיה תחת השפעה אנדוקנביאיד. השיטה גם ניתנת להרחבה לדגמי מחקר אחרים, מה שהופך אותו לשימושי עבור מטרות שונות. התקן, שהוכן כפי שדווח כאן, הוחל בהצלחה לפתח שיטת כרומטוגרפית מהירה ואמינה המאפשרת זיהוי וכימות יעילים של 2-AG באופן שאינו מתפקד.
אנדוקנבינואידים הם מחלקה של שומנים כי היו מעורבים בוויסות של היווצרות dauer ב -C. אלגיה7. באופן ספציפי יותר, סינתזה של חומצות שומן רב בלתי רווי (PUFAs) חשוב עבור סחר בכולסטרול ואת התפתחות הרבייה של תולעים. הוא נחשף כאן 2-AG, חומצה ארכידונית המכילה אנדוקאנביאיד, אחראי על restituting הזחל …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק מחקר של הסוכנות הלאומי Tecnológica y של המחקר (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., פ, ו B.H.C. הם ברנשים מ CONICET. D.d.M. ו G.R.L. הם חברי הקריירה המחקר של CONICET. אנו מודים לגונזלו לאמברטו (INMET) עבור ניתוח LC-MS/MS ודיון מועיל. הירי והעריכה של וידאו נעשה על ידי רמירו אורטגה ומריה סולאסולה Casasola מכיוון הבימוי של האופרה דה לה סינסיה, Faculøy דה Ciencia לראנוטיקה הביננייונאלס, אוניברסיהנאסיונאל דה רוסאריו ברוסאריו, ארגנטינה.
4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |