סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס
Summary
עבודה זו מתארת שיטה חזקה וישירה כדי לזהות ולכמת את האנדוקאנמיאיד 2-ארכאינול (2-AG) ב- C. אלגיה. תקן הניתוח האנליטי הינו מוכן ומשמש לקוונפיקציה של 2-AG על ידי איזונושא דילול וכרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרורינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
עבודה זו מציגה שיטה להכנת תקן אנליטי לניתוח 2-ארכאיקסיקסיל (2-AG) באיכות ובכמת של נוזלים כרומטוגרפיה-אלקטרולינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS). אנדוקנבינואידים נשמרים מתווכים השומנים המסדירים תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים. ב C. אלגיה, 2-AG נמצא בעלי תפקידים שונים, כולל אפנון של היווצרות דאואר ומטבוליזם הכולסטרול. דו ח זה מתאר שיטה להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של התקנים החיצוניים הדרושים לקוונפיקציה של 2-AG. ההליך לסינתזה של התקן הוא פשוט יכול להתבצע בכל מעבדה, ללא צורך מומחיות סינתזה אורגנית או ציוד מיוחד. בנוסף, מתוארת שינוי של השיטה של Folch לחלץ את התקן הדאומנטי מתרבות C. אלגיה . בסופו של דבר, שיטה כמותית ואנליטית לזהות 2-AG באמצעות isotopically יציבה התווית אנלוגי 1-AG-d5 מתואר, אשר מספק תוצאות אמינות לרוץ מהיר כרומאטוגרפי. הנוהל הוא שימושי עבור לימוד תפקידים מרובים של 2-AG ב C. אלגיה בעוד להיות ישימה למחקרים אחרים של מטבוליטים באורגניזמים שונים.
Introduction
אנדוקאנבינואידים לווסת תהליכים ביולוגיים מרובים במגוון של אורגניזמים הם שמרו מגשרים השומנים1. הגילוי הראשון והטוב ביותר המאופיין באנדוקאנבינואידים הם אנאנדאמיד (ארכאדונאוליטהלתנולאמיד, איה) ו-2-ארכאיקסיקסיל גליצרול (2-AG). אנדוקאנבינואידים לשחק תפקידים קריטיים רבים, כולל אלה המעורבים במערכות תגמול המוח, כמו גם התמכרות לסמים, זיכרון, מצב רוח, ותהליכים מטבוליים2. איה ו-2-AG הם רק מסונתז בעת הצורך ויש להם חיים קצרים משתרע, והם מושפל דרך חלבון התחבורה ספיגה חוזרת הידרוליזה3.
השימוש במודלים של בעלי חיים כמו האלמרנים (C. אלגיה) הפך חשוב ללמוד את המגוון הגדול של תהליכים ביולוגיים כולל אפופטוזיס, איתות תא, מחזור התא, קוטביות התא, תקנה גנים, חילוף חומרים, הזדקנות, וקביעת מין4,5. בנוסף, הג הוא מודל מצוין לחקר התפקידים הפיזיולוגיים של חומצות שומן רב בלתי רוויות (pufas). איה זוהתה ב -C. אלגיה ומצטמצמת תחת הגבלת תזונה6. מחסור זה מרחיב את תוחלת החיים של נמטודות באמצעות מנגנון הגבלה תזונתיים שניתן לדכא על ידי תוספת עם אנדוקאנביאיד. לאחרונה, נתגלה כי 2-AG ו-איה משחקים תפקידים בסיסיים בוויסות סחר בכולסטרול בג7. חשוב מכך, נקבע כי התוספת עם אקסוגני 2-AG יכול להציל את מעצר דאואר, אשר נגרמת על ידי סחר הכולסטרול לקוי של נימן לבחור סוג C1 C. אלגיה מוטציות.
כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי 2-AG עם סחר בכולסטרול ותהליכים ביולוגיים אחרים ב נמטודות (כלומר, איתות monoaminergic, נוקטונזיה ו תנועה), זה חיוני לחקור את המטסוגזה אנדודוגלי ואיך זה מושפע בתנאים סביבתיים ותזונתיים מסוימים8,9,10,11,12,13. לכן, זה הכרחי לעצב ולמטב את השיטה כדי לזהות ולכמת אנדוגני 2-AG ב C. אלגיה כי הוא פשוט לשימוש עבור מדענים של שדות שונים, במיוחד אלה הלומדים את התנהגותו של nematode ביחס זה . בסדר, אנדוקנביאיד
בשנת 2008, לטונטן ועמיתים לעבודה הצליחו לזהות 2-AG ו -“איה” ב-C. אלגיה באמצעות שיטות אנליטיות LC-MS14. ב 2011, הם הצליחו להרחיב את הטכניקה הזאת לאנדוקנבינואידים אחרים15. העבודה האחרונה הראתה שיטות אנליטיות אחרות אשר הצליחו באיתור וכימות אנדוקנבינואידים ב -C. אלגיה, כולל ספקטרומטר מסה ו-GC-MS16,17,18, והוא חייב דווח גם כי ניתן להרחיב שיטות אנליטיות דומות למודלים אחרים19.
בעבר דיווחו שיטות אנליטיות המשמשות לכימות 2-AG בדגימות ביולוגיות כוללות בדרך כלל את השימוש בתקנים דאוטים הנרכשים מסחרית ודורשים זמינות לרכישה20,21. סטנדרטים אנליטיים רבים עבור כימות LC-MS/MS של אנדוקאנבינואידים הם זמינים מסחרית מספקים שונים. עם זאת, הם יקרים, רגישים, ולהיות תחמוצת לאורך זמן, עקב נוכחות של איגרות חוב כפולות מרובות. הגרסאות השכיחות ביותר של תקנים אלה מבוססים על החומצה הארכידונית של octa-שניוני ומתאימות לקוונפיקציה על ידי דילול האיזוטופ LC-ms/ms14,22. כמו כן, רוב הסטנדרטים הללו מוחלף במיקום 2 של גליצרול, מה שהופך אותם לא יציבים ברוב התנאים מאז הם נוטים הגירה acyl19,23.
כדי להתגבר על הקשיים הקשורים לעלויות וליציבות של הסטנדרטים הללו, שיטה נוחה ופשוטה מוצגת להכנת תקן אנליטי המבוסס על גליצרול-d5. הרצף שמטרתו להכין את התקן המחומש מחייב הליך שלושה שלבים התוצאתו תקן 1-AG-d5, אשר יציב ואינו עובר הגירה acyl (הבעיה העיקרית כאשר מכוון לסנתז 2-monoacylglycerols).
המטרה העיקרית כאן היא להראות שיטה פשוטה ומנויית ללמוד 2-AG ב -C. אלגיה, כולל סינתזה של תקן הניתוח האנליטי, ההכנה והחילוץ של דגימות נמטודות, וניתוח על ידי LC-ms/MS (איור 1 ). הליך סינתטי זה הוא השגה ללא הידע סינתזה אורגני מתוחכם או ציוד מיוחד, מה שהופך אותו מתאים למדענים מתחומים שונים אשר לומדים את ההתנהגות C. אלגיה תחת השפעה אנדוקנביאיד. השיטה גם ניתנת להרחבה לדגמי מחקר אחרים, מה שהופך אותו לשימושי עבור מטרות שונות. התקן, שהוכן כפי שדווח כאן, הוחל בהצלחה לפתח שיטת כרומטוגרפית מהירה ואמינה המאפשרת זיהוי וכימות יעילים של 2-AG באופן שאינו מתפקד.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנדוקנבינואידים הם מחלקה של שומנים כי היו מעורבים בוויסות של היווצרות dauer ב -C. אלגיה7. באופן ספציפי יותר, סינתזה של חומצות שומן רב בלתי רווי (PUFAs) חשוב עבור סחר בכולסטרול ואת התפתחות הרבייה של תולעים. הוא נחשף כאן 2-AG, חומצה ארכידונית המכילה אנדוקאנביאיד, אחראי על restituting הזחל …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק מחקר של הסוכנות הלאומי Tecnológica y של המחקר (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., פ, ו B.H.C. הם ברנשים מ CONICET. D.d.M. ו G.R.L. הם חברי הקריירה המחקר של CONICET. אנו מודים לגונזלו לאמברטו (INMET) עבור ניתוח LC-MS/MS ודיון מועיל. הירי והעריכה של וידאו נעשה על ידי רמירו אורטגה ומריה סולאסולה Casasola מכיוון הבימוי של האופרה דה לה סינסיה, Faculøy דה Ciencia לראנוטיקה הביננייונאלס, אוניברסיהנאסיונאל דה רוסאריו ברוסאריו, ארגנטינה.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
