Caenorhabditis elegans 2-Arachidonoylglycerol Quantification için Bir Deuterated Standart Sentezi
Summary
Bu çalışma, C. elegansendokannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) tespit etmek ve ölçmek için sağlam ve basit bir yöntem açıklar. 2-AG’nin izotopik seyreltme ve sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile ölçülmesi için hazırlanmış ve kullanılan analitik bir deuterated standarttır.
Abstract
Bu çalışma sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) ile 2-arachidonoyl gliserol (2-AG) nitel ve nicel analiz etmek için analitik bir standart hazırlamak için bir yöntem sunar. Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenleyen lipid mediatörleri korunur. C. elegansyılında, 2-AG farklı rollere sahip olduğu bulunmuştur, dauer oluşumu ve kolesterol metabolizması modülasyonu da dahil olmak üzere. Bu rapor, 2-AG nicelleştirme için gerekli olan kısırlaştırılmış standartların maliyetleri ve istikrarı ile ilgili zorlukların üstesinden gelmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Standardın sentezi için prosedür basittir ve organik sentez uzmanlığı veya özel ekipmangerek kalmadan, herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Buna ek olarak, Folch yöntemic. elegans kültüründen deuterated standart ayıklamak için bir değişiklik açıklanmıştır. Son olarak, kararlı izotopik etiketli analog 1-AG-d5 kullanarak 2-AG’yi saptamak için nicel ve analitik bir yöntem tanımlanmıştır ve bu da hızlı kromatografik bir çalışmada güvenilir sonuçlar sağlar. Bu prosedür, c. eleganlarda 2-AG’nin birden fazla rollerinin incelenmesinde ve farklı organizmalardaki metabolitlerin diğer çalışmaları için de geçerli olmak için yararlıdır.
Introduction
Endofanbinoidler çeşitli organizmalarda birden fazla biyolojik süreci düzenler ve lipid aracıları korunur1. İlk keşfedilen ve en iyi karakterize endanabinoidler anandamid (arachidonoylethanolamide, AEA) ve 2-arachidonoyl gliserol (2-AG). Endokannabinoidler beyin ödül sistemleri nin yanı sıra uyuşturucu bağımlılığı, bellek, ruh hali ve metabolik süreçler de dahil olmak üzere birçok kritik rol oynamaktadır2. AEA ve 2-AG sadece gerektiğinde sentezlenir ve kısa kullanım ömrüne sahiptirler ve taşıma protein geri alımı ve hidroliz3ile bozulurlar.
Caenorhabditis elegans gibi hayvan modellerinin kullanımı(C. elegans)apoptoz, hücre sinyalizasyonu, hücre döngüsü, hücre polaritesi, gen regülasyonu, metabolizma, yaşlanma, ve cinsiyet belirleme4,5. Ayrıca, C. elegans çoklu doymamış yağ asitlerinin (PUFA) fizyolojik rollerini incelemek için mükemmel bir modeldir. AEA C. elegans tespit edilmiştir ve diyet kısıtlaması6altında azalır. Bu eksiklik endofanabinoid ile takviyesi ile bastırılabilir bir diyet kısıtlama mekanizması ile nematod ömrünü uzatır. Son zamanlarda, 2-AG ve AEA C. elegans7kolesterol ticaretinin düzenlenmesinde temel rol oynadığı keşfedilmiştir. Daha da önemlisi, bu eksojen 2-AG ile takviyesi Dauer arrest, Niemann-Pick tip C1 C. elegans mutantlar bozulmuş kolesterol ticareti neden olduğu kurtarma olabilir tespit edilmiştir.
2-AG’nin kolesterol ticareti ve nematoddaki diğer biyolojik süreçlerle (yani monoaminik sinyalizasyon, nosisepsiyon ve lokomotion) olan ilişkisini daha iyi anlamak için, bu endojen metabolitin incelenmesi ve nasıl olduğu bazı çevre ve beslenme koşulları altında etkilenen8,9,10,11,12,13. Bu nedenle, farklı alanlardaki bilim adamları için kullanımı kolay olan C. elegans’ta endojen 2-AG’yi tespit etmek ve ölçmek için bir yöntem tasarlamak ve optimize etmek zorunludur, özellikle de nematodun bu konudaki davranışlarını inceleyenler için. endkannabinoid.
2008 yılında, Lethonen ve iş arkadaşları LC-MS analitik yöntemler14kullanarak C elegans 2-AG ve AEA tespit başardı. 2011 yılında, diğer endokannabinoidler15bu tekniği genişletmek başardı. Daha yeni çalışmalar, c. elegansendokannabinoidlerin saptandırıp ölçülmesinde başarılı olan diğer analitik yöntemler göstermiştir , kütle spektrometresi ve GC-MS16dahil,17,18, ve ayrıca benzer analitik yöntemlerdiğer modellere genişletilebilirbildirilmiştir 19.
Biyolojik numunelerde 2-AG’nin ölçülmesi için kullanılan daha önce bildirilen analitik yöntemler genellikle ticari olarak edinilen ve satın alma için kullanılabilirlik gerektiren deuterated standartların kullanımını içerir20,21. Endofabinoidlerin LC-MS/MS sayısallaştırılması için birçok analitik standart farklı sağlayıcılardan ticari olarak mevcuttur. Yine de, onlar pahalı, duyarlı, ve zaman içinde okside olmak, birden fazla çift bağ varlığı nedeniyle. Bu standartların en yaygın sürümleri okta-deuterated araşidonik asit dayanmaktadır ve izotop seyreltme LC-MS/MS14tarafından nicelleştirmek için uygundur,22. Ayrıca, bu standartların çoğu gliserol pozisyon 2 ikame edilir, onlar asil göç eğilimli beri çoğu koşullar altında kararsız hale19,23.
Bu deuterated standartların maliyetleri ve istikrarı ile ilgili zorlukları aşmak için, gliserol-d dayalı analitik bir standart hazırlamak için uygun ve basit bir yöntem sunulmaktadır5. Penta-deuterated standart hazırlamak için sırası standart 1-AG-dsonuçlarıüç aşamalı bir prosedür gerektirir 5 , hangi istikrarlı ve asil göç geçmez (2-monoasilglisitler sentezamaçlayan ana konu).
Burada temel amaç, analitik olarak nötralizasyon standardının sentezi, nematod örneklerinin hazırlanması ve çıkarılması ve LC-MS/MS ile analiz dahil olmak üzere, C. eleganlarda2-AG’yi incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermektir (Şekil 1 ). Bu sentetik prosedür sofistike organik sentez bilgisi veya özel ekipman olmadan ulaşılabilir, endocannabinoid etkisi altında C. elegans davranış okuyor farklı alanlardan bilim adamları için uygun hale. Yöntem aynı zamanda diğer çalışma modelleri için genişletilebilir, farklı hedefler için yararlı hale. Burada bildirildiği gibi hazırlanan standart, 2 AG’nin etkili bir şekilde tekrarlanabilir bir şekilde saptanması ve ölçülmesi için hızlı ve güvenilir bir kromatografik yöntem geliştirmek için başarıyla uygulanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endocannabinoidler C. elegans7dauer oluşumunun düzenlenmesinde rol yapmış lipidlerin bir sınıfıdır. Daha spesifik olarak, çoklu doymamış yağ asitlerinin (PUPO) sentezi kolesterol ticareti ve solucanların üreme gelişimi için önemlidir. Burada 2-AG, endokannabinoid içeren bir araşidonik asit, bozulmuş kolesterolmetabolizmasıvar solucanlarda normal döngüsüne dauer larva geri sorumlu olduğu ortaya 7 .
Kolesterol tica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693) tarafından desteklenmiştir. J.F.d.L., G.P., ve B.H.C. CONICET’ten arkadaşlar. D.D.M. ve G.R.L. CONICET Araştırma Kariyeri üyesidir. Biz Gonzalo Lamberto (INMET) LC-MS / MS analizi ve yararlı tartışma için müteşekkiriz. Video çekimi ve kurgusu Dirección de Comunicación de la Ciencia’dan Ramiro Ortega ve María Soledad Casasola tarafından yapılmıştır, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Rosario, Arjantin’deki Universidad Nacional de Rosario.
Materials
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, &. #. 2. 1. 4. ;., Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
