Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analys av lipidhalten i fission och spirande jästsvampar med automatiserad bildbehandling

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Science, Charles University

Summary

Här presenterar vi en MATLAB implementering av automatiserad upptäckt och kvantitativ beskrivning av lipiddroppar i fluorescens mikroskopi bilder av fission och spirande jästceller.

Abstract

Lipidmetabolismen och dess reglering är av intresse för både grund-och tillämpad biovetenskap och bioteknik. I detta avseende, olika jästarter används som modeller i lipid metabolisk forskning eller för industriell lipidproduktion. Lipiddroppar är mycket dynamisk lagring organ och deras cellulära innehåll representerar en bekväm avläsning av lipidmetaboliska tillstånd. Fluorescensmikroskopi är en metod att välja för kvantitativ analys av cellulära lipiddroppar, eftersom den förlitar sig på allmänt tillgänglig utrustning och möjliggör analys av enskilda lipiddroppar. Dessutom kan mikroskopisk bildanalys automatiseras, kraftigt öka övergripande analys genomströmning. Här beskriver vi ett experimentellt och analytiskt arbetsflöde för automatiserad detektering och kvantitativ beskrivning av enskilda lipiddroppar i tre olika modell jästarter: fission jäst Schizosaccharomyces pombe och Schizosaccharomyces japonicus, och den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. Lipiddroppar visualiseras med BODIPY 493/503, och cell-impermeable fluorescerande dextran läggs till kulturen medierna att hjälpa till att identifiera cell gränser. Celler utsätts för 3D-epifluorescens-mikroskopi i gröna och blåa kanaler och de resulterande z-stackbilderna bearbetas automatiskt av en MATLAB-pipeline. Proceduren visar rika kvantitativa data om cellulär lipidinnehåll och enskilda lipiddroplet-egenskaper i tabellformat som lämpar sig för efterföljande analyser i större kalkylblads-eller statistiska paket. Vi tillhandahåller exempel analyser av lipidinnehåll under olika förhållanden som påverkar cellernas lipidmetabolism.

Introduction

Lipider spelar en avgörande roll i cellernas energi-och koldioxidmetabolism, syntes av membran komponenter och produktion av bioaktiva substanser. Lipid metabolism finjusteras enligt miljöförhållanden, näringsämnes tillgänglighet och cell-Cycle fas1. Hos människor, lipid metabolism har kopplats till sjukdomar, såsom fetma, typ II diabetes och cancer2. Inom industrin utgör lipider som produceras av mikroorganismer, såsom jästsvampar, en lovande källa till förnybara dieselbränslen3. Celler lagrar neutrala lipider i så kallade lipiddroppar (LDs). Dessa bevarade evolutionärt förkroppsligar komponeras av triacylglycerols, steryl estrar, en yttre fosfolipid enskiktslager och tillhörande proteiner1. LDs har sitt ursprung i endoplasmatiska Retikulum, utöva cell-Cycle eller tillväxt-fas dynamik, och är viktiga för cellulära lipid homeostas1. LD nummer och morfologi kan användas som en bekväm proxy när testmetoder lipid metabolism under olika tillväxtförhållanden eller när screening en panel av mutanter. Med tanke på deras dynamiska karaktär, tekniker som kan analysera egenskaperna hos enskilda LDs är av särskilt intresse i studier av lipidmetabolismen.

Olika jästarter har använts för att beskriva lipidrelaterade metaboliska vägar och deras reglering, eller används i bioteknik för att producera intressanta föreningar eller bränslen1. Dessutom, för modell jäst, såsom spirande jäst Saccharomyces cerevisiae eller avlägset relaterade fission jäst Schizosaccharomyces pombe, genomomfattande borttagning stam bibliotek finns tillgängliga som kan användas för hög genomströmning skärmar4,5. Nyligen LD sammansättning och dynamik har beskrivits i S. pombe6,7,8,9, och mutanter relaterade till lipidmetabolismen har isolerats i den framväxande modellen jäst Schizosaccharomyces japonicus10.

Det finns många tekniker för att studera LD-innehåll och dynamik. De flesta anställer någon form av färgning av LDs med lipofila färgämnen som Nile Red eller BODIPY 493/503. Den senare visar mer smala excitation och emission Spectra, och ökad specificitet mot neutrala lipider (LDs) i motsats till fosfolipider (membran)11. Fluorimetriska och flödescytometri metoder har använts framgångsrikt i olika svamparter att avslöja gener och tillväxtförhållanden som påverkar lagring lipidhalten12,13,14,15. Även om dessa metoder lämpar sig för tillämpningar med högt dataflöde kan de inte mäta antalet och morfologin hos enskilda LDs i celler, vilket kan skilja sig dramatiskt mellan tillväxtförhållanden och genotyper. Sammanhängande Raman spridning eller digital holografisk mikroskopi är etikettfria metoder som ger LD-nivå data, men kräver specialiserad dyr utrustning16,17,18. Fluorescens mikroskopi, å andra sidan, kan ge detaljerade uppgifter om LD innehåll, samtidigt som de använder allmänt tillgängliga instrument och bildanalys mjukvaruverktyg. Flera analys arbetsflöden finns som har olika grader av förfining och automatisering i cell/LD-detektering från bilddata, och är optimerade för olika celltyper, till exempel metazoan celler med stora LDs19,20 , 21, eller blivande jästsvampar17,22,23. Vissa av dessa metoder fungerar bara i 2D (t. ex. på maximala projektionsbilder), vilket kan undgå att tillförlitligt beskriva det cellulära LD-innehållet. Till vår kännedom, inga verktyg finns för bestämning av LD innehåll och morfologi från fission jäst mikroskopiska data. Utveckling av automatiserade och robusta LD-nivåanalyser skulle ge ökad känslighet och ökad statistisk kraft, och ge rik information om neutralt lipidinnehåll, helst i flera jästarter.

Vi har utvecklat ett arbetsflöde för LD innehållsanalys från 3D fluorescens mikroskopi bilder av jästceller. Levande celler färgas med BODIPY 493/503 och Cascade Blue dextran att visualisera LDs och bestämma cell gränser, respektive. Cellerna är immobiliserade på glas rutschbanor och utsätts för z-stack Imaging med hjälp av ett standard epifluorescensmikroskopi Mikroskop. Bilderna bearbetas sedan av en automatiserad pipeline som implementeras i MATLAB, ett allmänt använt (kommersiellt) paket för statistiska analyser. Pipelinen utför bildförbehandling, segmentering (celler kontra bakgrund, borttagning av döda celler) och LD-identifiering. Rich LD-nivådata, som LD-storlek och fluorescensintensitet, tillhandahålls sedan i ett tabellformat som är kompatibelt med större kalkylbladsverktyg. Arbetsflödet har använts framgångsrikt för att bestämma effekten av kvävekälla tillgänglighet på lipidmetabolismen i S. pombe24. Vi visar nu funktionaliteten i arbetsflödet i s. pombe, s. japonicus och s. cerevisiae, med hjälp av tillväxtvillkor eller mutanter som påverkar cellulära LD innehåll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av lösningar och media

  1. Förbered lipidfärgnings lösning.
    1. För att förbereda lager lipid färgning lösning lös 10 mg BODIPY 493/503 i 10 mL vattenfri DMSO (slutlig koncentration 1 mg/mL). Lös upp hela innehållet i en 10 mg BODIPY 493/503 injektionsflaska för att förhindra förlust av material under vägning.
      Försiktighet: DMSO kan passera genom huden. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    2. Förbered arbetande lipidfärgning lösning genom att blanda 100 μL av 1 mg/mL BODIPY 493/503 stamlösning och 900 μL av vattenfri DMSO (slutlig koncentration 0,1 mg/mL).
    3. Aliquot de lager och arbetslösningar, och lagra vid-20 ° c.
      Anmärkning: Upplöst BODIPY 493/503 är stabil i flera år vid-20 ° c. Lösningen måste dock skyddas mot fukt och ljus.
  2. För att bereda stamlösning för cell gräns visualisering, lös 25 mg kaskad blå dextran (hela flaskan) i 2,5 mL avjoniserat vatten (slutlig koncentration 10 mg/mL). Aliquot stamlösning och förvara vid-20 ° c skyddat från ljus.
  3. För att förbereda Mikroskop glid beläggning lösning, lös 5 mg sojabönor lektin i 5 ml avjoniserat vatten (slutlig koncentration 1 mg/ml). Alikvot av lektin lösning och förvara vid-80 ° c.
    Anmärkning: Lektin-lösningen är stabil i flera år vid-80 ° c. Alikvoter som för närvarande används kan förvaras vid-20 ° c.
  4. Förbered odlingsmediet.
    1. För att förbereda 400 mL av komplexa Ja odlingssubstrat för s. pombe och s. japonicus, lös 2 g jästextrakt och 0,1 g av SP kosttillskott (om det krävs för auxotrophic mutanter) i 340 ml avjoniserat vatten i en 500 ml flaska och autoklav. Tillsätt 60 mL 20% (w/v) separat autoklav eller filtersteriliserat glukos under aseptiska förhållanden.
    2. För beredning av 400 mL av det definierade EMM-odlingsmediet för s. pombe och s. japonicus, Lös 4,9 g EMM-buljong utan dextros i 360 ml avjoniserat vatten i en flaska med 500 ml och autoklav. Tillsätt 40 mL 20% (w/v) separat autoklav eller filtersteriliserat glukos under aseptiska förhållanden.
      Anmärkning: För allmänna riktlinjer för odling av s. pombe och s. japonicus , se25 respektive26.
    3. För att förbereda 300 ml av komplex YPAD odlingssubstrat för Saccharomyces cerevisiae, lös 3 g jästextrakt, 6 g pepton och 30 mg adeninsulfat i 270 ml avjoniserat vatten i en 500 ml flaska och autoklav. Tillsätt 30 mL 20% (w/v) separat autoklav eller filtersteriliserat glukos under aseptiska förhållanden.
    4. För att förbereda 300 mL av definierade minimala mediet för S. cerevisiae, lös 2 g jäst kväve bas (utan aminosyror) i 270 ml avjoniserat vatten i en 500 ml flaska och autoklav. Tillsätt 30 mL 20% (w/v) separat autoklav eller filtersteriliserat glukos under aseptiska förhållanden.
      Anmärkning: Allmänna riktlinjer för odling av S. cerevisiae se27.

2. cell odling

  1. Växande s. pombe eller s. japonicus till exponentiell eller tidig stationär fas.
    1. På morgonen, Inokulera 5 mL Ja medium med färsk fission jäst biomassa. Inkubera vid 32 ° c med skakning (180 rpm) i flera timmar.
      Anmärkning: För alla odlingar, Använd Erlenmeyer kolvar med 10 gånger volymen av kulturen för att säkerställa ordentlig luftning. Vissa laboratorier föredrar att odla fission jäst vid 30 ° c, men odlings temperatur på 32 ° c resulterar i kortare fördubblings tider utan skadliga effekter på cellerna, vilket minskar den totala tiden som krävs för att utföra ett experiment25,28 .
    2. På sena eftermiddagen samma dag (efter minst 6 timmars odling), späd kulturen med färskt Ja medium till en 10 mL slutlig kultur volym så att den når önskad optisk densitet (OD) (eller antal celler/mL) följande morgon, och inkubera vid 32 ° c med s Hakning (180 rpm). Det är av fördel att känna till fördubblings tiden för varje Använd stam för att exakt bestämma utspädningsfaktorn (Använd ekvation 1).
      Equation 1
      Där vkultur är den preculture volym som behövs för utspädning, vFinal är den totala volymen av den nya kulturen (10 ml för standard odlingar), ODFinal är den önskade OD som skall uppnås efter morgonen är ODCurrent den för närvarande uppmätta OD av preculture, t är tiden för celltillväxt tills skörd, tlag är varaktigheten av lag fasen (beror på laboratorieförhållanden, måste definieras empiriskt) och tDT är fördubblings tiden för stammen.
      Anmärkning: När exponentialfasceller ska analyseras, låt inte precultures nå den stationära fasen eftersom detta dramatiskt förändrar cellfysiologi (inklusive LD-innehåll) för flera efterföljande generationer.
    3. På morgonen Imaging Day, om kulturen nådde något högre OD än vad som krävs (i händelse av exponentiell fas celler), späd den med färskt Ja och fortsätta inkubering för minst två dubblering gånger innan färgning av LDs. annars gå direkt till färgning (avsnitt 3).
  2. Växande S. cerevisiae till exponentiell och stationär fas.
    1. På eftermiddagen, Inokulera 10 mL YPAD medium med en liten mängd färsk spirande jäst biomassa och inkubera över natten vid 30 ° c med skakning (180 rpm).
    2. Morgonen av Imaging Day, späd kulturen till OD 0,1 i 10 mL YPAD medium och växa till den erforderliga OD (t. ex., OD 1 för exponentiell fas). Utför eventuella odlings utspädningar enligt beskrivningen i steg 2.1.2. Gå vidare till färgning (avsnitt 3).

3. färgning av lipiddroppar

  1. Förbered en Mikroskop täckslip för varje prov som skall avbildas. Sprid 1 μL glid beläggnings lösning på en ren täckslip med hjälp av långsidan av en horisontellt placerad pipettspets. Låt beläggnings lösningen torka helt och förvara locket glider i en dammfri miljö.
    Anmärkning: Glas rutschbanor och täckband kan rengöras före användning vid behov. Rengöringsproceduren består av tvättning med diskmedel, sköljning med vatten, övernattning i 3% saltsyra och tvättning med destillerat vatten. Rengjorda glidbanor och täckglas förvaras i ren etanol fram till användning.
  2. Mät OD för cellodling eller antal celler/mL, efter behov. Försök att nå liknande värden bland alla testade stammar för att säkerställa jämförbara experimentella förhållanden.
  3. Pipettera 1 mL av varje cellkultur till ett 1,5 mL microcentrifugerör. Endast för S. cerevisiae , tillsätt 5 μl av glid beläggnings lösningen, Vortex kort och inkubera vid 30 ° c med skakning i 5 min.
  4. Tillsätt 1 μL av lipidfärgningslösningen till varje kultur alikvot och vortexta kortfattat. Tillsätt sedan 10 μL av visualiserings lösningen för cellgränsen och skaka en kort stund.
    Anmärkning: Förbered inte pre-blandade lösningar av båda fläckar eftersom detta leder till fluorescens släckning av BODIPY 493/503.
  5. Samla cellerna genom centrifugering (1 000 x g, 3 min, RT) och ta bort nästan alla supernatanten (~ 950 μl). Omsuspendera cellerna i den återstående supernatanten.
  6. Pipettera över 2 μL av den täta cellsuspensionen på en lectin-belagd täckslip och placera den på ett rent Mikroskop glas. Cellerna ska bilda en monolayer. Gå vidare till mikroskopi (avsnitt 4) så snabbt som möjligt för att minimera artefakter vid avbildning; bearbeta maximalt två prov i taget.

4. inställning av Mikroskop och bildbehandling

  1. Optimera avbildnings förhållanden.
    Anmärkning:     att ställa in mikroskopet kräver långa exponeringar mot starka ljuskällor som kan orsaka skador på provet och skeva resultat. Ställ därför in avbildnings villkoren med hjälp av en särskild prov bild som inte kommer att användas ytterligare för LD-kvantifiering.
    1. Fokusera på cellerna med hjälp av faskontrast eller differential störnings kontrast (DIC).
      Anmärkning: Faskontrast eller DIC-bilder kan tas som referens, men de används inte under det automatiserade bildanalys steget.
    2. Ställ in z-stack inställningar för att spänna över hela cell volymen. Det totala vertikala avståndet beror på cellstorleken. antalet optiska segment beror på mål punktens numeriska bländare (punkt spridnings funktionen i z-axeln). Ställ in fokus på att flytta i förhållande till det centrala fokalplanet.
      Anmärkning: Det optimala antalet skivor ställs ofta in av programvaran för Mikroskop styrning och behöver inte beräknas manuellt. De typiska cell bredderna är 3-5 μm för s. pombe, 4-7 μm för s. japonicus, och 3-7 μm för s. cerevisiae.
    3. Till bild LDs, ange ljusintensitet och exponeringstid i den gröna kanalen (excitation och emission Maxima av BODIPY är 493 respektive 503 nm).
      Anmärkning: BODIPY 493/503 är en mycket ljus fluorochrome; Det kan dock bli blekt snabbt med alltför stark ljusintensitet. Dessutom är LDs mobila i levande celler, vilket minimerar exponeringstiden och fångar den fullständiga gröna-kanals z-stacken först (innan du byter till den blå kanalen) för att förhindra suddigt artefakter. Ta också hänsyn till kamerans linjära räckvidd för signalintensitet för att undvika mättade pixlar.
    4. För att bild cell gränser, ange ljusintensitet och exponeringstid i den blå kanalen (excitation och emission Maxima av Cascade Blue dextran är 400 och 420 nm, respektive).
      Anmärkning: Signalintensiteten i den blå kanalen krävs för bildsegmentering, men den används inte för LD-kvantifieringen. Därför är optimala inställningar i den här kanalen inte avgörande för analys.
    5. Om möjligt, skapa ett automatiserat experiment arbetsflöde i Mikroskop kontrollprogramvara för att underlätta avbildning av flera prover under standardiserade förhållanden.
  2. När bildförhållandena har optimerats ska bild prov användas för kvantifiering. Fokusera på cellerna och bild dem i grönt och blått kanaler som beskrivs i steg 4,1.
    Anmärkning: Alla avbildningar måste förvärvas med samma inställningar för att möjliggöra jämförelse mellan exemplen. Bild flera vyfält per sampling för att erhålla robusta, representativa data.
  3. Spara de blå och gröna kanal bilderna i z-stacken som 16-bitars TIFF-filer med flera lager (d.v.s. två filer per synfält). Inkludera orden "grön" eller "blå" i motsvarande filnamn. Fortsätt med bildanalys (avsnitt 5).

5. bildanalys

  1. Kontrollera kvaliteten på de förvärvade bilderna visuellt.
    1. Öppna mikroskopiska bilder i imagej29,30 eller annan lämplig bildanalysprogram vara.
    2. Ta bort alla bildstaplar som innehåller ett stort antal celler som flyttats under anskaffningen (och därmed skapat suddigt artefakter).
    3. Ta bort alla bildstaplar som innehåller mycket fluorescerande icke-cellpartiklar i den blå kanalen (t. ex. smuts på Mikroskop glaset eller täckslip, föroreningar i odlingsmediet).
      Anmärkning: Mycket ljusa icke-cell objekt i den blå kanalen kan skapa cell identifiering artefakter eller kan störa upptäckten av celler i deras närhet.
    4. Ta bort alla bildstaplar som innehåller en stor andel döda celler (d.v.s. celler med ökad blå fluorescens jämfört med levande celler).
      Anmärkning: Även om närvaron av en liten andel av döda celler i provet är vanligtvis inte ett problem och dessa celler automatiskt kasseras under analys, vissa döda eller döende celler kan ibland kännas igen som levande celler av segmenteringsalgoritmen och därmed skeva de rapporterade resultaten.
  2. Analysera bilder i MATLAB-programvaran.
    1. Skapa en huvudmapp och kopiera alla MATLAB-skript till den här platsen.
    2. Skapa en underordnad mapp ("pombe", "cerevisiae" eller "japonicus") och kopiera indatatiff-bildfiler till den här platsen.
    3. Starta MATLAB, öppna script MAIN. m och kör det. I menyn väljer jäst arter som ska analyseras och starta bildbehandling.
      Anmärkning: Några av de parametrar som krävs för cell-och LD-detektering är förinställda för den aktuella arten, andra bestäms automatiskt under bildbehandling. De förinställda värdena bestämdes empiriskt och beror på flera faktorer som objektiv förstoring, kameratyp och känslighet samt bildinställningar. Om det behövs kan användare redigera skriptfilerna för att ändra de organisationsspecifika för inställningarna så att de bättre återspeglar deras experimentella inställningar. Nämligen under cell igenkänning accepteras objekt storlekar ges av "minArea" och "maxArea" parametrar, och den minsta delen av fylld volym inom objekt gränserna ges av "soliditet" parametern. För LD-igenkänning ges tröskelvärdet för ljusstyrka av "th"-parametern (dess värde påverkas mestadels av bildens bitdjup och fluorescenssignalintensitet), och högsta godtagbara LD-storlek ges av parametern "MaxArea".
    4. Inspektera och bearbeta utdatafilerna efter behov med hjälp av en kalkylblads redigerare eller ett statistiskt paket; arbetsflödet producerar semikolonavgränsade CSV-filer och segmenterade TIFF-filer med identifierade cell objekt och LDs.
      Anmärkning: Arbetsflödet segmenterar bilder i bakgrunds-och cell objekt, där varje cell objekt kan bestå av flera intilliggande celler. Därför representerar utdata i "xxxx_cells. csv" filer inte encellig data och bör endast användas för att beräkna per enhet av cell-volymmått.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hela förfarandet sammanfattas i figur 1 för fission jäst (den spirande jästen arbetsflödet är analog), och nedan ger vi exempel på hur arbetsflödet kan användas för att studera LD innehåll i tre olika jästarter under olika förhållanden kända för att påverka cellulär LD-innehåll. Varje exempel representerar ett enda biologiskt experiment.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt diagram över experiment-och analys arbetsflödet. Arbetsflödet för fission jästsvampar visas som ett exempel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Först analyserade vi S. pombe -celler (figur 2). Vildtyp (WT; h + s) celler odlades till exponentiell fas i antingen komplexa Ja medium eller definierade EMM medium. Jämfört med Ja, upptäcktes färre LDs och högre LD-färgintensitet per enhet av cell volym i EMM (figur 2A-C). Dessutom var enskilda LDs som bildades i EMM-mediet större och visade ökad total färgintensitet (figur 2D, E). Detta är i samförstånd med tidigare fynd av ökad lagring lipidhalten i celler som odlas i EMM24. Den ppc1 genen kodar en phosphopantothenate-cystein Ligase som krävs för coenzym en syntes. Den temperaturkänsliga ppc1-88 Mutant visar en markant minskning av LD-halten när den odlas vid den restriktiva temperaturen31, vilket ger ett exempel på celler med låg bodipy 493/503 signal (figur 2A). Jämfört med vildtyp (som odlas vid 32 ° c) upptäcktes mindre LDs med lägre total Färgnings intensitet i ppc1-88 celler som ODLATS i Ja efter en övergång till 36 ° c (figur 2D, E), utan någon uppenbar förändring av LD-nummer per enheten för cell volym (figur 2b).

Figure 2
Figur 2: effekter av tillväxt medier och lipidmetabolism mutation på LD-halten i S. pombe. Wild Type (WT) och ppc1-88 celler odlades till exponentiell fas i det komplexa Ja eller definierade EMM-mediet, enligt indikerat. WT-celler odlades vid 32 ° c. De temperaturkänsliga ppc1-88 cellerna odlades vid 25 ° c och flyttades till 36 ° c i 2 timmar före analys. A) representativa obearbetade mikroskopiska bilder av LDs färgade med bodipy 493/503. Ett enda optiskt segment visas för varje villkor; 10% overlay med inverterad blå kanal lades till för att bättre visualisera cell gränser. Skalstapel = 10 μm. (B) antal identifierade LDs per enhet av cell volym. C) fluorescensintensitet för identifierade LDs per enhet av cell volym. D) fördelning av totala fluorescensintensiteter för alla identifierade LDs. * * *, # # # oparade Wilcoxon test p = 1,7 x 10-107, p = 3,7 x 10-132, respektive. (E) fördelning av volymer av alla identifierade LDs. * * *, # # # oparade Wilcoxon test p = 6,8 x 10-71, p = 1 x 10-64, respektive. Data i panelerna B-E härleddes från 242, 124 och 191 cell objekt för WT YES, WT EMM respektive ppc1-88 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Därefter kvantifierades LD-halten i S. japonicus -celler (h+matsj-2017)32 från exponentiella och tidiga stationära kulturer odlade i Ja (figur 3a). Celler som går in i stationär fas uppvisade markant minskat antal LDs per enhet cell volym jämfört med exponentiellt växande celler (figur 3b), medan volymnormaliserade LD-fluorescensintensiteten minskade något mellan de två förhållandena ( Diagram 3c). De tidiga stationärt-fas LDs var typiskt måttligt större i storlek och hade måttligt högre total fluorescensintensitet jämfört med LDs från exponentiellt växande celler (figur 3D, E).

Figure 3
Figur 3: LD-innehåll i S. japonicus celler förändras med tillväxtfas. Exponentiellt växande (LOG) och tidiga stationära fas (STAT) celler analyserades. A) representativa obearbetade mikroskopiska bilder av LDs färgade med bodipy 493/503. Ett enda optiskt segment visas för varje villkor; 10% overlay med inverterad blå kanal lades till för att bättre visualisera cell gränser. Skalstapeln representerar 10 μm. (B) antal identifierade LDs per enhet av cell volym. C) fluorescensintensitet för identifierade LDs per enhet av cell volym. D) fördelning av totala fluorescensintensitet för alla identifierade LDs. * * * oparade Wilcoxon test p = 1,3 x 10-114. (E) fördelning av volymer av alla identifierade LDs. * * * oparade Wilcoxon test p = 2,4 x 10-85. Data i panelerna B-E härleddes från 274 och 187 cell objekt för LOG och STAT prover, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Slutligen, Vi analyserade S. cerevisiae celler av den utbredda BY4741 laboratorie stammen (MATa His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) vuxit till exponentiell och stationär fas, respektive, i den komplexa YPAD medium. Spirande jästceller ackumuleras vanligtvis lagring lipider vid inträde i stationär fas1, och vi kunde recapitulate dessa fynd (figur 4). Stationära celler innehöll något färre LDs per volymenhet jämfört med exponentiellt växande celler (figur 4b), men deras volymnormaliserade LD-fluorescensintensitet nästan fördubblades (figur 4c). Denna kraftiga ökning av det totala LD-innehållet berodde på den mycket högre fluorescensintensiteten och volymen av enskilda LDs i stationär fas (figur 4D, E).

Figure 4
Figur 4: LD-innehåll i S. cerevisiae celler förändras med tillväxtfas. Exponentiellt växande (LOG) och stationära fas (STAT) celler analyserades. A) representativa obearbetade mikroskopiska bilder av LDs färgade med bodipy 493/503. Ett enda optiskt segment visas för varje villkor; 10% overlay med inverterad blå kanal lades till för att bättre visualisera cell gränser. Skalstapeln representerar 10 μm. (B) antal identifierade LDs per enhet av cell volym. C) fluorescensintensitet för identifierade LDs per enhet av cell volym. D) fördelning av totala fluorescensintensitet för alla identifierade LDs. * * * oparade Wilcoxon test p = 4,6 x 10-78. (E) fördelning av volymer av alla identifierade LDs. * * * oparade Wilcoxon test p = 3,7 x 10-63. Data i panelerna B-E härleddes från 430 och 441 cell objekt för LOG och STAT prover, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sålunda, vår analys arbetsflöde kan upptäcka förändringar i LD-nummer, storlek och lipid innehåll i tre olika och morfologiskt distinkta jäst arter under olika förhållanden som positivt eller negativt påverka cellulära LD innehåll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förståelsen av lipidmetabolismen och dess reglering är viktig för både grundläggande biologi, och kliniska och bioteknologiska tillämpningar. LD innehåll utgör en bekväm avläsning av lipidmetabolismen tillståndet i cellen, med fluorescens mikroskopi är en av de viktigaste metoderna som används för LD innehåll bestämning. Det presenterade protokollet möjliggör automatisk detektering och kvantitativ beskrivning av enskilda LDs i tre olika och morfologiskt distinkta jästarter. Till vår kännedom finns inga liknande verktyg för fission jäst. De MATLAB-skript som krävs för bildbehandling inkluderas som tilläggsfiler och är även tillgängliga från Figshare-förvaret (DOI 10.6084/M9. figshare. 7745738) tillsammans med alla råa och bearbetade bild-och tabelldata från detta manuskript, detaljerade beskrivningar av CSV-utdatafilerna och R-skript för nedströms dataanalys och visualisering. Den senaste versionen av MATLAB-skripten är också tillgänglig från GitHub (https://github.com/MartinSchatzCZ/LipidDots-analysis).

En lyckad LD-analys är till stor del beroende av kvaliteten på de rå fluorescens-bilder som erhålls. För optimal prestanda för segmenteringsalgoritmerna, bör rena glas bilder utan dammpartiklar användas för mikroskopi, cellerna bör bilda en enskiktslager (det faktiska antalet celler per synfält är inte en kritisk parameter), och bör inte innehålla en en stor andel döda celler. Dessutom bör z-stack Imaging börja något under och slutar något över cellerna. Beroende på den specifika mikroskopiska installationen kan användarna behöva justera några av parametrarna i bildbehandlings skripten (till exempel "th" för tröskelvärde för bild bakgrunds intensitet). Medan den nuvarande metoden kan identifiera och beskriva enskilda LDs i segmenterade cell objekt, producerar arbetsflödet inte verkligt encellsdata på grund av svårigheter med automatiserad separation av alla enskilda celler. I stället rapporteras LD-innehåll per enhet av cell volym generaliserad för hela provet. Denna begränsning kan hämma tolkningen av data i analyser av heterogena cellpopulationer. Också, försiktighet bör iakttas när man arbetar med celler med förändrad transport av små molekyler (t. ex., effluxpump mutanter), eftersom detta kan påverka den intracellulära BODIPY 493/503 koncentration och LD färgning, som observerats för Nilen röd lipofila färgämne33 , 34.

Färgning mediet med cell-impermeable Cascade Blue fluorescerande dextran är ett bekvämt sätt att skilja celler från bakgrunden35, som kan tillämpas på många (om inte alla) jäst arter. Det hjälper också till med automatisk borttagning av döda celler från analysen eftersom dessa kommer att bli blå vid färgning. Alla döende eller sjuka (och därmed delvis permeabla för dextran) celler som upptäcks som levande kan tas bort under dataanalys steg baserat på värdet "IntensityMedianBlue" för identifierade cell objekt. I princip kan hela arbetsflödet användas för att upptäcka olika andra cellulära strukturer, såsom DNA-reparation Foci, förutsatt att strukturerna kan märkas med lämpliga fluorofotar. Arbetsflödet bör också tillämpas på celler av andra (jäst) arter, ytterligare bredda dess nytta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 och SVV 260310. Vi tackar Ondřej ŠEBESTA för hjälp med mikroskopi och utveckling av bilden analyspipeline. Vi tackar ReGenEx Lab för s. cerevisiae stammar, och Japonet och Hironori Niki ' s Lab för s. japonicus stammar. Den ppc1-88 stammen tillhandahölls av jästen genetiska resurs Center Japan. Mikroskopi utfördes i laboratoriet av Konfokal och fluorescens mikroskopi medfinansierat av Europeiska regionala utvecklingsfonden och Tjeckiens statsbudget (Projektnr. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 och CZ. 2.16/3.1.00/21515).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) - Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22 mm x 22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 mm x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
Pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
Standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

Tags

Immunologi och infektion neutral lipid lagring fluorescens mikroskopi kvantitativ mikroskopi BODIPY 493/503 Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces japonicus Saccharomyces cerevisiae
Analys av lipidhalten i fission och spirande jästsvampar med automatiserad bildbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Princová, J., Schätz, M.,… More

Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter