يصف هذا البروتوكول الاعداد الأصلي الذي يجمع بين قياسات مدي الحياة الطيفية والفلورية لتقييم نقل الطاقة بالرنين فورستر (الحنق) بين المجسات الفلورية القائمة علي الرورامين والليغنين البوليمر مباشره في الأقسام النباتية السميكة.
في الكتلة الحيوية ليغنوسيلولوسيك (LB), نشاط الانزيمات محدود بظهور تفاعلات غير محدده مع اللينين اثناء عمليه التحلل المائي, الذي يحافظ علي الانزيمات بعيدا عن الركيزة الخاصة بهم. التالي فان توصيف هذه التفاعلات المعقدة يشكل تحديا في ركائز معقده مثل LB. يقيس الأسلوب هنا التفاعلات الجزيئية بين الجزيئات الموسومة بالفلور والليغنين الفلورية الاصليه ، ليتم الكشف عنها بواسطة نقل الطاقة بالرنين فورستر (الحنق). وخلافا لقياسات التاكل في الخلايا الحية باستخدام اثنين من الفلوروبيورس الخارجية ، وقياسات التاكل في النباتات باستخدام الليبين ليست تافه بسبب الفلورية المعقدة. لقد قمنا بتطوير خط أنابيب الاستحواذ والتحليل الأصلي مع ملاحظه مترابطة من اثنين من الخصائص التكميلية للفلوري: الانبعاثات الفلورية ومدي الحياة. يوفر sFLIM (المجهر التصوير مدي الحياة الطيفية والفلورسنت) القياس الكمي لهذه التفاعلات مع حساسية عاليه ، والكشف عن مستويات التفاعل المختلفة بين الجزيئات الحيوية والليغنان.
التحلل الحراري للقشور السكرية في السكريات الاحاديه مثل الجلوكوز يتطلب الانزيمات. ومن المعروف ان نشاطهم مقيد بإنشاء تفاعلات غير محدده بين الانزيمات والليغولين1،2، وهذا الأخير هو البوليمر مسعور والمكونة الرئيسية لليغنوسيلولوسي3. التالي ، فان القياس الكمي لهذه التفاعلات مباشره علي النطاق الخلوي يشكل تحديا يجب التصدي له لتحسين النشاط الحفاز الانزيمي والمعالجة المسبقة لليغنوسيلولوسي4.
فورستر (أو فلوري) قياس نقل الطاقة بالرنين (الحنق) هو وسيله للاختيار لتقويم التفاعل الجزيئات الحيوية في الموقع. ويمكن ان يحدث هذا النقل غير الإشعاعي للطاقة بين المتبرع والفلوريد المتقبل إذا كانت تستوفي شروطا مختلفه. المانحة أذاعه طيف ينبغي تداخلت, علي الأقل جزئيا, المتقبلات أثاره طيف. التالي فان اختيار الفلوروبيورس حاسم لمثل هذه التجارب. ثم ، تنخفض كفاءه النقل مع القوه السادسة من المسافة5 ويحدث فقط إذا كانت كل الجزيئات في منطقه قريبه (عاده في نطاق نانومتر). ويمكن للطوارئ الأخرى ان تغير كفاءه النقل ، مثل الاتجاه ثنائي القطب والثنائي القطب ، ولكن يتم تخفيفها إذا كانت الفلور الفلورية تتمتع بالمرونة.
ويمكن قياس التاكل عن طريق تقنيات مختلفه ويمكن الاطلاع علي أوصاف مفصله في الأدب6،7. وباختصار ، تعتمد الطرق الرئيسية علي: ‘ 1 ‘ الانبعاثات الواعية التي يتبع فيها التباين في مضان الانبعاثات المتقبلة ويوفر نتائج نوعيه أساسا ؛ ‘ 2 ‘ الرشح الضوئي الذي يقاس فيه مضان انبعاثات المتبرع قبل وبعد النض الضوئي المتقبل (في هذه الحالة ، يمكن تحقيق تقديرات أكثر دقه لل “ولكنها تتطلب قوه ليزر قويه مطبقه علي العينات الثابتة) ؛ والثالث) قياس مدي الحياة التي تنخفض للمانح في وجود متقبل. هذا الأسلوب يتطلب أدوات محدده ويسمح قياسات التفاعل الدقيقة والحساسة بين الفلوروبيورس. النظر إلى قياس الحنق بين المجسات الفلورية والليغنوسيلوللوز ، فان الصعوبة الرئيسية هي ان اللينوكريبوللوز ليست فلوكوفيري واحده تتميز بشكل جيد: فهي تحتوي علي الفلورية الاصليه القوية والطيفية ، والتي تنبع أساسا من اللينوسين ، وتعتمدعلي أنواع الكتلة ال
في هذه الورقة ، نقترح اجراء جديد والأصلي تكييفها لأجزاء من الخشب/عينات النباتات. هذه الطريقة القائمة علي sFLIM يفتح الطريق إلى قياسات التاكل الكمية بين مجسات الفلورسنت والليغولين في عينات اللينوكولوللوز الاصليه.
وتسمح القياسات الطيفية لمدي الحياة والانبعاثات بالجمع بين مزايا كلا الأسلوبين. والواقع ان القياسات الطيفية وحدها تفتقر إلى الحساسية وتظل نوعيه. ومن ناحية أخرى ، فان عمر الفلورية هو الطريقة المفضلة لقياسات التاكل الكمية التقليدية ، ولكن ثبت ان الليبين التلقائي يمكن ان يختلف تبعا لتكوين اللينان والبيئة16. التالي ، لا يمكن التمييز بين التفاعلات الليلينان مع التغييرات الهيكلية المتقبلة أو الليقبين لأنهما يؤديان إلى انخفاض مدي الحياة. وكما هو موضح ، فان الطريقة المطورة توفر قياسا واضحا وحساسا وكميا للتفاعلات بين جزيئات الليبين والمتقبلين في الأقسام النباتية. حتى لو كانت الخطوات المختلفة للأسلوب الأمثل بصرامة ، يجب توخي الحذر بشكل خاص للنقاط التالية.
وفيما يتعلق بالعينات ، فان نوعيه قسم النبات أمر بالغ الاهميه لضمان التصوير في التركيز. يجب اتباع الخطوات المختلفة لتضمين PEG بدقه. خطوه الغسيل النهائية ضرورية لضمان عدم وجود تداخل من PEG المتبقية في العينات. وعلاوة علي ذلك ، يجب ان تبقي تركيز العازلة ودرجه الحموضة متطابقة تماما لجميع القياسات لان اي تغيير يمكن ان يكون لها تاثير قوي علي خصائص الفلورية.
قياس مدي الحياة يمكن أيضا ان تكون حساسة. العمر الفلوري للمتبرع يمكن ان يكون غير مستقر ، علي سبيل المثال بسبب أثاره عاليه. في مثل هذه الحالة ، وضبط قوه الليزر والتكبير يمكن إصلاح هذه المسالة. وثمة مصدر آخر معروف جيدا للقطع الاثريه في قياسات TCSPC هو تراكم نبض الفوتون. في الواقع ، TCSPC لا يمكن قياس سرعه اثنين من الفوتونات المنبعثة بين نفس النبضات الليزر اثنين. في حين ان العينات النباتية عاليه التنظيم ، فان الفلورية ليست متجانسة ويمكن ان تؤدي إلى تاثير النبض الخفي. في حين ان عدد الفوتونات في الثانية لا يزال دون حد الاثاره 1 ٪ ، فانه يمكن ان يكون اعلي في بعض المناطق عينه. ولضمان عدم اجراء تجارب الاختبار ، يمكن النظر في قياس مدي عمر المتبرع بالفلورية في تدفق فوتون مختلف. إذا زاد العمر اثناء انخفاض التدفق ، فان تاثير الاصطدام هو تغيير القياسات. يتم التوصل إلى تدفق الفوتون الأمثل مع استقرار المتبرع مدي الحياة.
وفيما يتعلق تحليل منحني تسوس sFLIM ، نوصي بالاعتماد علي كل منحني الفردية تناسب لضمان ان النموذج يصف بدقه القياسات. وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فتاكد أولا من ان أيا من المصنوعات اليدوية المذكورة سابقا قد أفسد البيانات. وبعد ذلك ، توفر الخطوة 2-1-4 وظيفة الاستجابة الفعالة (IRF) الخاصة بالنظام. إذا كان IRF يعرض بعض الشذوذ ، وتحسين المسار البصري للتقليل منها. ويمكن أيضا ان تستخدم IRF قياس لتركيب خلال الخطوة 6.2. وأخيرا ، يمكن زيادة درجات النموذج المناسب للحرية إلى اضمحلال ثلاثي الاسي في الخطوة 6.2. ومع ذلك ، فان عدد الفوتونات المطلوبة لمده الحياة الفردية وتحديد نسبه عاليه التالي فمن المستحسن استخدامها فقط لتحقيق متوسط عمر أكثر استقرارا من الخطوة 6.4. أكثر شامله معلومة علي [فلم], توصيفه 18, [سفليم] وتطبيقه12 بشكل خاص إلى [ليغسن]10, يستطيع كنت أسست في الأدب.
علي الرغم من التحدي ، وقياس التاكل في الانسجه النباتية باستخدام الفلورية الاصليه يظهر بعض المزايا. بالمقارنة مع القياسات التي أجريت علي الانسجه الحية التي التفاعل الدراسات بين الجزيئات الحيوية في كثير من الأحيان تتطلب الهندسة الوراثية للتعبير عن علامات الفلورسنت المتاصله ، والانسجه النباتية ليغنيفيد مثل تلك المعروضة هنا ، تقدم الطبيعية ويمكن بسهوله أضافه الفلورية ، والشريك الخارجي تحقيقات الفلورسنت ، وتوفير الكثير من الوقت. ومع ذلك ، اعتمادا علي الأنواع النباتية تحليلها وعلي العلاجات المسبقة الممكنة التي نفذت ، من المرجح ان يتم تعديل الفلورية ، بحيث انه يحتاج إلى ان تتميز بعناية والفلورية المستخدمة كتحقيقات قد تحتاج إلى تكييفها.
يجب تطبيق الأسلوب sFLIM علي تحقيقات الفلورسنت التي تفتقر إلى النشاط الحفاز (PEG و ديكسان). في اطار التحلل المائي النباتي ، يمكن اجراء تفاعلات الانزيمات في عينات الكتلة الحيوية المختلفة ، مما قد يؤدي إلى تحديد تاثير التعريب (الخلايا والانسجه) علي قوه التفاعل. ستكون خطوه التحسين التالية أتمته خطوه التحليل. في الواقع ، مع البيانات التي تم تحليلها بما فيه الكفاية ، يمكن نشر اجراء تحليل قائم علي التعلم الألى للتحليل التلقائي للنمط الظاهري ، والذي من شانه ان يزيد من قدرته علي الفحص السريع لكفاءة الانزيم الكتلة الحيوية. وعلاوة علي ذلك ، لا يتطلب sFLIM تثبيت العينة ويمكن تطبيقها بسهوله علي الدراسات التفاعلية انزيم-ليغنان التفاعل. ومن المرجح ان هذه الطريقة الفريدة لتوجيه استراتيجية هندسه الانزيم والكتلة الحيوية المعالجة المسبقة لتحسين تثمين الليكوسيلوللوز.
The authors have nothing to disclose.
وأعرب عن شكره الحار فاني لوران (اجره) لاعداد الأرقام. ويعترف بالاتحاد البحثي FRABio (جامعه ليل ، CNRS) لتوفير البيئة التقنية المفضية إلى تحقيق هذا العمل. وتم الحصول علي التمويل من وكاله البحوث الوطنية الفرنسية (مشروع LIGNOPROG ANR-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |