该协议描述了结合光谱和荧光寿命测量的原始设置,以评估在厚植物部分直接测定基于红胺的荧光探针和木质素聚合物之间的Fürster共振能量转移(FRET)。
在木质纤维素生物量(LB)中,酶的活性受到水解过程中与木质素的非特异性相互作用的影响,而木质素保持酶远离其基质。因此,这些复杂相互作用的特征是LB等复杂基板的一个挑战。该方法测量荧光标记分子与原生自荧光木质素之间的分子相互作用,由Fürster共振能量转移(FRET)揭示。与使用两种外源性荧光荧光源的活细胞中的FRET测量相反,由于木质素复杂的自荧光,在植物中使用木质素的FRET测量并非易事。我们开发了一个原始的采集和分析管道,对荧光的两个互补特性进行相关观察:荧光发射和寿命。sFLIM(光谱和荧光寿命成像显微镜)提供高灵敏度的这些相互作用的定量,揭示生物分子和木质素之间的不同相互作用水平。
水解木纤维素到单糖,如葡萄糖需要酶。其活性已知受到酶和木质素1、2之间非特异性相互作用的建立的制约,后者是疏水性聚合物和木质纤维素3的主要成分。因此,在细胞规模上直接定量测量这种相互作用是一个挑战,必须解决,以优化酶催化活性和木质纤维素预处理4。
Fürster(或荧光)共振能量转移(FRET)测量是一种选择的方法,用于在原位对生物分子相互作用进行评估。这种非辐射能量转移可能发生在供体和受体荧光酸之间,如果它们满足不同的条件。供体发射谱必须重叠,至少部分重叠接受器激励谱。因此,荧光草的选择对于这种实验至关重要。然后,传输效率随着距离5的第六功率而降低,并且仅在两个分子都靠近(通常在纳米范围内)时才会发生。其他意外情况可能会改变传输效率,如偶极子定向,但如果荧光道具有灵活性,则可缓解。
FRET可以通过不同的技术来测量,详细的描述可以在文献6,7中找到。总之,主要方法依赖于:(一) 敏感发射,其中接受器发射荧光的变化遵循,主要提供定性结果;ii) 接受者光漂白,其中供体发射荧光测量之前和之后接受者光漂白(在这种情况下,可以实现更精确的FRET估计,但需要强大的激光功率应用于固定样品);和 iii) 在接受者在场的情况下,供体减少的寿命测量。此方法需要特定的仪器,并允许在荧光量之间进行精确和敏感的相互作用测量。考虑到荧光探针和木纤维素之间的FRET测量,主要困难是木质纤维素不是单一的很好地特征的荧光素:它具有很强的原生和光谱范围的自荧光,主要来自木质素,并依赖于生物量物种8,9。
在本文中,我们提出了一个新的和原始的程序,以适应部分木材/植物样品。这种基于sFLIM的方法为在原生木纤维素样品中的荧光探针和木质素之间的定量FRET测量开辟了道路。
关联荧光寿命和发射光谱测量可以结合两种方法的优点。事实上,光谱测量本身缺乏灵敏度,而且保持定性。另一方面,荧光寿命是传统定量FRET测量的首选方法,但事实证明,木质素自荧光可能因木质素成分和环境而异。因此,木质素与接受器或木质素结构变化的相互作用不能被区分,因为它们都会导致寿命减少。如所演示的,开发的方法对植物部分木质素和接受分子之间的相互作用进行了明确、敏感和定量的测量。即使对方法的不同步骤进行了严格优化,也必须特别注意以下几点。
关于样品,工厂部分的质量对于确保聚焦成像至关重要。应严格遵守 PEG 嵌入的不同步骤。最后的洗涤步骤对于确保样品中不残留的 PEG 干扰至关重要。此外,缓冲液浓度和pH值在所有测量中应严格保持一致,因为任何变化都会对荧光特性产生强烈的影响。
终生测量也可能很精细。供体的荧光寿命可能不稳定,例如因为高激发。在这种情况下,调整激光功率和变焦可以解决此问题。TCSPC 测量中另一个众所周知的人工制品来源是光子脉冲堆积。事实上,TCSPC 无法测量同一两个激光脉冲之间发射的两个光子的速度。虽然植物样品结构高度结构化,但荧光不均匀,可能导致隐藏的脉冲堆积效应。虽然每秒的光子数仍然低于 1% 的激发限制,但在某些采样区域,光子数可能更高。为了确保没有堆积实验,可以考虑以不同的光子通量测量供体荧光寿命。如果寿命增加,而通量减少,堆积效应正在改变测量。最佳光子通量与捐赠者的寿命稳定性相一起实现。
关于sFLIM衰减曲线分析,我们建议依靠每个单独的曲线拟合,以确保模型准确描述测量值。如果不是这样,首先确保前面提到的人工制品都没有损坏数据。然后,步骤 2.1.4 提供了系统的仪器响应功能 (IRF)。如果 IRF 出现一些异常,请优化光路以最小化它们。也可以使用用于步骤 6.2 期间的装配测量 IRF。最后,在步骤 6.2 中,拟合模型的自由度可以增加到三衰减。但是,单个寿命和比例确定所需的光子数量很高,因此建议仅使用它们来实现步骤 6.4 中更稳定的平均寿命。关于FLIM的详尽资料,其特征18,sFLIM及其应用12,特别是木质素10,可以在文献中找到。
尽管具有挑战性,但使用原生自荧光在植物组织中进行 FRET 测量显示出一些优势。与对活组织进行的FRET测量相比,生物分子之间的相互作用研究往往需要基因工程来表达内在的荧光标记,这里介绍的木质素植物组织提供了天然自动荧光和外向伙伴荧光探头可以很容易地添加,节省大量时间。然而,根据分析的植物种类和可能进行的预处理,自荧光可能会被修改,因此需要仔细描述,并可能需要调整用作探针的荧光。
sFLIM方法必须应用于缺乏催化活性的荧光探头(PEG和dextran)。在植物木质纤维素水解框架中,可以在各种生物量样品中进行酶的相互作用,这可能导致确定定位(细胞和组织)对相互作用强度的影响。下一个优化步骤将是分析步骤的自动化。事实上,通过足够的分析数据,可以部署基于机器学习的分析程序进行自动表型分析,这将提高其可操作性,以快速筛选酶-生物量效率。此外,sFLIM不需要固定样品,并可以很容易地应用于动态酶-木质素相互作用研究。这种独特的方法有可能指导酶工程策略和生物量预处理,以优化木质纤维素的抗性。
The authors have nothing to disclose.
范妮·洛朗(FARE)对编制这些数字表示衷心感谢。FRABio研究联合会(里尔大学,CNRS)因提供有利于实现这项工作的技术环境而得到承认。资金来自法国国家研究局(利诺普罗格项目ANR-14-CE05-0026)。
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |