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Neuroscienze

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

Published: September 19, 2019
doi:
10.3791/59950
, , , ,
1The Children’s Hospital, School of Medicine,Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine,Zhejiang University

Summary

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

Abstract

포유류 게놈에서 여러 DNA 변형이 확인되었다. 그 중, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 매개 후생유전학 적 메커니즘이 집중적으로 연구되었습니다. 5-하이드록시메틸시토신은 뇌의 배아 및 산후 발달 시 동적 특징을 표시하고 유전자 발현에서 조절 기능을 하며 여러 신경 장애에 관여합니다. 여기서, 우리는 마우스의 배양 된 세포 및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸 사이토신을 검출하기 위해 면역 형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 포함한 상세한 방법을 설명합니다.

Introduction

DNA 변형, 히스톤 변형 및 RNA 변형을 포함한 후생 유전학적 변형은 다양한 생물학적 과정과 질병1,2,3에서필수적인 기능을 하는 것으로 나타났습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7.오랜 시간 동안, DNA 메틸화(즉, 5-메틸시토신(5-mC))는 매우 안정적인 후성유전학 적 마커로서 간주되어 왔으며 게놈에서 더 이상 변형될 수 없다. 최근, 5-mC는 TET1, TET2 및 TET38,9를포함하는 TET(11-11전좌) 패밀리 단백질에 의해 5-하이드록시메틸시토신(5-hmC)으로 산화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가 연구는 5-hmC가 안정한 마커로 작용할 수 있고 유전자 발현조절을통해 생물학적 역할을 할 수 있음을 보여준다4,10,11,12.

본 증거는 5-hmC가 포유동물의 다른 유형의 조직에 비해 신경 조직/세포에서 고도로 농축되고, 신경 발달13,14동안 동적 특징을 나타낸다는 것을 나타낸다. 신경 시스템에서, 5-hmC 중재 후생 유전학 수정 신경 줄기 세포를 조절에 중요 한 역할을, 신경 활동, 학습 및 메모리, Rett 증후군을 포함 하 여 여러 신경 질환에 관여, 자폐증, 알 츠 하이 머 병 질병, 헌팅턴병 등2,13,15,16,17,18,19,20.

세포 및 조직14,21,22,23,24에서5-hmC를 검출하기위한 몇 가지 접근법이 있습니다. 여기에서, 우리는 5-hmC의 존재를 검출하고 5-hmC의 글로벌 수준을 정량화하는 2개의 방법을 기술합니다: 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩. 이 두 가지 방법은 편리하고 민감하며 이전 연구25,26,27,28,29,30에서성공적으로 사용되었습니다. 이 두 방법의 주요 단계는 DNA 변성입니다. 5-hmC의 면역 형광 염색을 위해 1 M HCl로 시료를 전처리해야합니다. 5-hmC 도트 블롯의 경우 NAOH 용액으로 DNA 변이가 수행됩니다. 이 두 가지 방법은 차세대 시퀀싱과 함께 5-hmC의 기능을 조사하는 데 매우 유용한 도구입니다.

Protocol

모든 동물 절차는 절강 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 성인 신경 줄기 세포와 뉴런의 문화 성인의 전뇌로부터 성체 신경줄기세포를 분리(8-10주령) C57/BL6 수컷 마우스는 앞서31,32. 배양 성인 신경 줄기 세포DMEM/F-12 배지에서 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 보충제, 1% 항생제 항마이코제, 및 37°C에서 5%<su…

Representative Results

성인 마우스의 해마에서 5-hmC의 분포를 밝히기 위해, 우리는 신경 세포 (NeuN) 및 5-hmC에 대한 항체로 면역 형광을 수행했습니다. 해마에서, 5-hmC는 뉴런 세포 마커 NeuN(그림1A-H)과잘 국소화되어 뉴런에서 5-hmC의 농축을 시사한다. 신경 발달 도중 5-hmC의 역학을 결정하기 위하여는, 점 얼룩은 증식하고 분화한 성인 신경 줄기 세포 (NSC)에서 분리된 …

Discussion

후성 유전학 수정은 뇌 발달, 성숙 및 기능 중에 필수적인 역할을합니다. DNA 변형을 위한 안정한 마커로서, 동적 5-hmC는 행동 적응, 신경 활성에 반응하고, 유전자 발현과 긍정적으로 상관관계가 있다; 따라서, 뇌 및 신경 장애의 정상적인 기능에 관여4. 세포와 조직에서 의 기능을 탐구하려면 5-hmC의 존재를 감지하고 치료 전후의 수준을 비교해야합니다. 여기에서, 우리는 실험실?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XL은 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFE0196600)과 중국 국립자연과학재단(Grant Nos. 31771395, 31571518)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Q.S.는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2017YFC1001703)과 절강성의 주요 연구 개발 프로그램(2017C03009)의 지원을 받았습니다. W.X.는 절강성 자연과학 재단(LY18H020002)과 절강성 과학기술부(2017C37057)의 지원을 받았습니다.

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
neurobasal medium Gibco 21103-049
normal goat serum Vector Laboratories Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
proteinase K VVR 39450-01-6
retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210
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Riferimenti

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Keywords: 5-hydroxymethylcytosine5hmCImmunofluorescenceDNA Dot-blotNeural Stem CellsMouse BrainEpigenetic ModificationGene ExpressionNeurological DisordersPerfusionFixationCryosectioningImmunostaining
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Citazione di questo articolo
Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).
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