Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.
In het genoom van zoogdieren zijn meerdere DNA-modificaties geïdentificeerd. Van die, 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine-gemedieerde Epigenetische mechanismen zijn intensief bestudeerd. 5-hydroxymethylcytosine toont dynamische kenmerken tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling van de hersenen, speelt een regelgevende functie in genexpressie, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen. Hier beschrijven we de gedetailleerde methoden, waaronder immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot om 5-hydroxymethylcytosine in gekweekte cellen en hersenweefsels van de muis te detecteren.
Epigenetische modificaties, waaronder DNA modificatie, Histon modificatie en RNA modificatie, is aangetoond dat het spelen van essentiële functies in diverse biologische processen en ziekten1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. voor een lange tijd, DNA-methylatie (dat wil zeggen, 5-methylcytosine (5-mC)) is gezien als een zeer stabiele epigenetische marker en kan niet verder worden gewijzigd in het genoom. Onlangs, het is gebleken dat 5-mC kan worden geoxideerd tot 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) door TET (ten-elf translocaties) familie-eiwitten, met inbegrip van TET1, TET2, en TET38,9. Verdere studies tonen aan dat 5-HMC kan dienen als een stabiele marker en spelen biologische rollen door het reguleren van genexpressie4,10,11,12.
De huidige bewijzen geven aan dat 5-HMC sterk is verrijkt in neuronale weefsels/cellen ten opzichte van andere soorten weefsels in zoogdieren, en vertoont dynamische kenmerken tijdens neuronale ontwikkeling13,14. In het neuronale systeem, 5-hmC gemedieerde epigenetische modificaties spelen een belangrijke rol bij het reguleren van neurale stamcellen, neuronale activiteit, leren en geheugen, en is betrokken bij meerdere neurologische aandoeningen met inbegrip van Rett syndroom, autisme, Alzheimer ziekte, de ziekte van Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Er zijn verschillende benaderingen voor het opsporen van 5-HMC in cellen en weefsels14,21,22,23,24. Hier beschrijven we twee methoden om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het wereldwijde niveau van 5-hmC te kwantificeren: immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot. Deze twee methoden zijn handig en gevoelig, en zijn met succes gebruikt in eerdere studies25,26,27,28,29,30. De belangrijkste stappen van deze twee methoden zijn DNA-denaturatie. Voor immunofluorescentie kleuring van 5-hmC is pre-behandeling van monsters met 1 M HCl vereist. Voor 5-hmC dot-Blot wordt DNA-denaturatie uitgevoerd met NaOH-oplossing. Deze twee methoden samen met de volgende generatie sequencing zijn zeer nuttig hulpmiddelen voor het onderzoeken van de functie van 5-hmC.
Epigenetische modificaties spelen essentiële rollen tijdens de ontwikkeling van de hersenen, rijping, en functie. Als een stabiele marker voor DNA-modificatie, reageert Dynamic 5-hmC op gedrags aanpassing, neuronale activiteit, en is positief gecorreleerd met genexpressie; Dus, het is betrokken bij de normale functie van de hersenen en neurologische aandoening4. Om zijn functie in cellen en weefsels te verkennen, is het noodzakelijk om het bestaan van 5-hmC te detecteren en het niveau voor en na …
The authors have nothing to disclose.
XL werd deels gesteund door de nationale sleutel R & D-programma van China (2017YFE0196600), en de National Natural Science Foundation of China (Grant NOS. 31771395, 31571518). Q.S. werd gesteund door de National Key Research and Development Program van China (2017YFC1001703) en de belangrijkste onderzoeks-en ontwikkelingsprogramma van de provincie Zhejiang (2017C03009). W.X. werd gesteund door de Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY18H020002) en Science Technology Department van de provincie Zhejiang (2017C37057).
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
GlutaMax | Thermo | 35050061 |
L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
OCT | Leica | 14020108926 |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
Triton X-100 | Solarbio | T8210 |