גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה
Summary
הציג כאן הוא צעד אחר צעד הליך כדי לגרום לפציעה ריאה חריפה בעכברים על ידי ישירה intratracheal ליפוסכאלפסיד ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמכתשי נוזל ששטיפה, ורקמות ריאות. מיניציה מינימלית, טיפול פשוט, תוכנות טובה, ו טיטור של חומרת המחלה הם יתרונות של גישה זו.
Abstract
מינהל דרכי הנשימה של ליפופוליסכד (LPS) היא דרך נפוצה לחקר דלקת ריאות ופגיעה בריאות חריפה (ALI) במודלים של בעלי חיים קטנים. היבטים שונים תוארו, כגון האינהלציה של aerosolized LPS, כמו גם אפי או intrracheal הסטילציה. הפרוטוקול המוצג מתאר נוהל צעד אחר צעד מפורט כדי לגרום לעלי בעכברים על ידי ישיר intratracheal לחות ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמישיים ששטיפה (BAL) נוזל, ורקמות ריאות. לאחר הרגעה הצפק פנימי, קנה הנשימה נחשף ו-LPS מנוהל באמצעות צנתר הווריד 22 G. תגובה דלקתית חזקה ומיועלת עם הפלישה הלוקוטית, upregulation של ציטוקינים proinflammatory, ושיבוש של מחסום מכתשי-נימים מושרה בתוך שעות לימים, בהתאם למינון LPS בשימוש. איסוף דגימות דם, נוזל בל וקצירת ריאות, כמו גם עיבוד לניתוח FACS, מתוארים בפרוטרוט בפרוטוקול. למרות שהשימוש ב-LPS סטרילי אינו מתאים לחקר התערבויות פרמקולוגית במחלות זיהומיות, הגישה המתוארת מציעה החלטיות מינימלית, טיפול פשוט, ומענה טוב למענה על שאלות אימונולוגיות מכניסטיות. יתר על כן, מינון המינון, כמו גם שימוש אלטרנטיבי LPS ההכנות או זנים העכבר לאפשר אפנון של ההשפעות הקליניות, אשר יכול להציג דרגות שונות של החומרה ALI או מוקדם לעומת התפרצות מאוחרת של תסמיני המחלה.
Introduction
מודלים ניסיוניים לבעלי חיים הינם חיוניים במחקרים חיסוניים בסיסיים. מינהל של חיידקים שלמים או מרכיבים מיקרוביאלית נעשה שימוש תכוף במודלים בעלי חיים קטנים כדי לגרום לדלקת מקומית או מערכתית1. ליפופוליסכריד (LPS, או אנדוטוקסין חיידקי) הוא רכיב קיר תא ואנטיגן פני השטח של חיידקים גראם שליליים (למשל, בריקובאכניים, פסאודומונס spp.). המולקולה התרמויציבה והגדולה (משקל מולקולרי 1-4 x 106 kda) מורכב moiety השומנים (ליפיד a), אזור הליבה (oligosaccharide), ו-o רב סוכר (או אנטיגן o). ליפיד A, עם שרשראות חומצות שומן הידרופובי שלה, עוגנים את המולקולה לתוך קרום חיידקי ו סכסוכי (על השפלה של חיידקים) את הפעילות החיסונית רעילות של lps. בעקבות הכריכה לחלבון איגוד lps (LBP), lps: LBP מתחמי פסיקים CD14/TLR4/MD2 מורכבות הקולטן ממוקם על המשטח של סוגי תאים רבים, גרימת תגובה חזקה proinflammatory עם טרנסלוקציה גרעינית NF-κB והבאים upregulation ביטוי של ציטוקין2.
פגיעה חריפה בריאות (עלי) מוגדרת ככשל נשימתי חריף באמצעות בצקת בריאות דו-צדדית בהיעדר אי ספיקת לב3. מינהל דרכי הנשימה של lps היא דרך נפוצה כדי לגרום לדלקת ריאתי עלי4,5,6,7. למרות שהחומר הסטרילי אינו מתאים לחקר התערבויות פרמקולוגית במחלות זיהומיות, ניתן לענות על שאלות אימונולוגיות מכניסטיות בדיוק מספיק. הסטיזילציה של LPS לתוך קנה הנשימה גורמת תגובה דלקתית חזקה עם הפלישה לוקיציט, upregulation של ציטוקינים proinflammatory, ושיבוש של מחסום מכתשי-נימי בתוך שעות לימים, בהתאם למינון LPS3, 6,7.
הפרוטוקול המוצג מתאר נוהל צעד אחר צעד מפורט כדי לגרום לעלי בעכברים על ידי intratracheal לדבר. המודל אומת על ידי הערכת ביטוי ציטוקין, הפלישה נויטרופילים, ו מכתשיים הדליפה בתוך מכתשי כמתואר בעבר8.
Protocol
Representative Results
Discussion
פולשני מינימלי, טיפול פשוט, ומהווה מאפיינים טובים הם תכונות מפתח של הגישה המוצגת כדי לגרום ALI במודל מכרסם קטן. השימוש LPS במקום חיידקים שלמים במודלים לבעלי חיים יש יתרונות. זהו תרכובת יציבה וטהורה, וניתן לאחסנם בצורה ליאופטוחה עד לשימוש. זהו ממריץ חזק עבור תגובות החיסונית מולדים באמצעות מסל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ליאן קליינר וסוזן שולץ על מתן תמיכה טכנית. המחברים מכירים בתמיכה המצוינת של מתקן הליבה של הזרם cy, בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת בון. המחברים לא קיבלו מימון מארגון חיצוני כלשהו. חלק מהנתונים שניתנו במקטע התוצאות ומתוארים באיור 3 כבר הוצגו בפרסום קודם8.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
Riferimenti
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).
- D’Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS – approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), 378-384 (2017).
