Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi
Summary
Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.
Abstract
Mitokondriyal nükleoidler, proteinlerle kaplanmış mitokondriyal DNA molekülleri tarafından oluşturulan kompakt parçacıklardır. Mitokondriyal DNA, tRNA’ları, rRNA’ları ve birkaç temel mitokondriyal polipeptidi kodlar. Mitokondriyal nükleoidler, fizyon/füzyon ve diğer morfolojik değişikliklerden geçen dinamik mitokondriyal ağ içinde bölünür ve dağıtır. Yüksek çözünürlüklü canlı floresan mikroskopisi bir nükleoidin konumunu ve hareketini karakterize etmek için basit bir tekniktir. Bu teknik için, nükleoidler genellikle protein bileşenlerinin floresan etiketleri ile etiketlenir, yani transkripsiyon faktörü a (TFAM). Ancak, bu strateji, eserlere (TFAM için rapor) neden olabilecek floresan protein etiketli bir yapının aşırı ifade edilmesine ihtiyaç duyar ve birçok durumda mümkün değildir. Organik DNA bağlayıcı boyalar bu dezavantajları yok. Ancak, her zaman hem nükleer hem de mitokondriyal DNA’ların boyanmasını gösterirler, böylece mitokondriyal nükleoidlere özgüllükten yoksundurlar. Bu boyaların fiziko-kimyasal özelliklerini göz önünde bulundurarak, bir nükleik asit jel lekesi (SYBR Gold) seçtik ve canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin tercihli etiketlemesini sağladık. Boyanın özellikleri, özellikle DNA’ya bağlanan yüksek parlaklığı, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma görüntülerinin zaman serilerini kullanarak mitokondriyal nükleoid hareketinin sonraki nicelikselleştirilmesine izin verir.
Introduction
Dairesel 16.5 kbp DNA molekülleri mitokondrigenetik malzemesini oluşturur, 22 tRNA, 2 rRNA ve 13 polipeptidleri kodlar? Mitokondriyal DNA mitokondriyal transkripsiyon faktörü a (TFAM) ve diğer bazı proteinler mitokondriyal nükleoidler1formu bağlı ,2,3,4. Mitokondriyal nükleoidler hareket ve mitokondriyal ağ bileşenleri arasında yeniden dağıtmak5,6 onun morfolojik remodeling sırasında, fisyon veya füzyon hücre döngüsü fazına bağlı olarak, stres, ve diğer faktörler (Pernas ve ark.7gözden). Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin hareketi, sistemik lupus eritematozus hastalığı8 karıştığı ve diğer hastalıklarda rol oynayabilir. Floresan mikroskopisi organellerin canlı hücre çalışmaları için basit bir tekniktir, ancak bu teknik mitokondriyal nükleoidlerin boyutundan daha büyük olan >200 nm çözünürlüğe sahiptir (~100 nm9,10,11,12). Bu sınır, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) ve tek molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM)13,14gibi sözde “süper çözünürlüklü” teknikler tarafından atlatılmıştır. Şimdiye kadar, mitokondriyal nükleoidler ve diğer DNA’lar canlı hücrelerde doğrudan stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM)15ile görüntülenmiştir. Canlı hücrelerde STED tarafından mtDNA ile ilişkili pozisyonlara sahip ince alt mitokondriyal yapılar gözlenmiştir16. Ancak, bu süper çözünürlük teknikleri canlı hücreler üzerinde fototoksik etkilere neden olan yüksek aydınlatma yoğunluğu gerektirir17. Bu nedenle, kırınım sınırının ötesinde çözünürlüğe sahip mitokondriyal nükleoidlerin zaman atlamalı görüntülemesi zordur. Bu sorunu gidermek için süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM)18kullandık. SIM STED ve SMLM19daha çok daha düşük bir aydınlatma güç dozu gerektirir. Ayrıca, STED ve SMLM teknikleri aksine, SIM basit çok renkli üç boyutlu (3D) görüntüleme izin verir, ve floroforlar veya görüntüleme tampon kompozisyon belirli fotofiziksel özellikleri gerektirmez19.
Canlı hücrelerde mitokondriyal nükleoidlerin etiketlemisiyal strateji, TFAM20gibi bir mitokondriyal nükleoid proteinin floresan etiketlemesidir. Ancak, birçok durumda, bu strateji uygun değildir. Ayrıca, floresan protein etiketli TFAM aşırı ifade ciddi bir artifakıüretir 21. DNA’nın organik boyalarla etiketlemi floresan protein (FP) tabanlı bir stratejiye göre avantajlıdır. Organik boyalar FP etiketlemeile ilgili kısıtlardan arındırılır: her türlü hücre veya doku için kullanılabilir ler ve bir deneyin herhangi bir noktasında uygulanabilirler. Mitokondriyal nükleoidlerin canlı hücre görüntüleme si birkaç DNA bağlayıcı boyalar ile bildirilmiştir: DAPI22, SYBR Yeşil23, Vybrant Boya Döngüsü24, ve picoGreen15,25,26. Nükleoid etiketleme için DNA bağlayıcı boyaların çoğunun önemli bir dezavantajı hücre içindeki tüm DNA’yı lekelemeleridir. Boyayı sadece mitokondriyal DNA’ya yönlendirmek son derece arzu edilir. Bunu başarmak için, uygun fiziko-kimyasal özelliklere sahip bir boya dikkatli seçimi gereklidir. Rhodamine 123 gibi lokalize pozitif yüke sahip lipophilic boyaların, negatif membran potansiyelini koruyan canlı mitokondride biriktiği bilinmektedir. Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin özel etiketleme için ideal bir boya yüksek afinite sahip DNA bağlamak ve DNA bağlama üzerine parlak floresan yontmak gerekir. Bu gereksinimleri göz önünde bulundurarak, bazı siyanürler umut verici (örneğin, picoGreen), ama nükleer DNA bol miktarda mitokondriyal DNA15,,25,26ile aynı anda bu boyalar tarafından lekeli . Bu protokol, canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin başka bir siyanür boyası olan SYBR Gold (SG) ile özel etiketlemesini ve zaman atlamalı süper çözünürlüklü SIM videolarında nükleoidlerin takibini açıklamaktadır. Ayrıca, SG lekeli canlı hücreler, canlı hücreler için uygun ve 488 nm ışık kaynağı ile donatılmış ters floresan mikroskop (konfokal, iplik diski, epifloresan, vb) her türlü görüntülenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolün birkaç kritik bileşeni vardır: Mitokondriyal DNA’nın tercihli etiketlemesini sağlamak için, kuluçka sırasında DNA bağlayıcı boyakonsantrasyonu çok düşük tutulmalıdır (örn. tipik bir ticari stoğun 1:10.000 seyreltilmesi) ve kuluçka süresi 30 dakika olmalıdır. Kuluçka süresi asla 1 h.’yi geçmemelidir. diğer DNA bağlayıcı boyalar düşük konsantrasyonda etiketleme üzerine güçlü bir sinyal oluşturmak için yeterince parlak değildir.
Protokolümüz?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Asifa Akhtar ve Angelika Rambold (hem Max Planck Enstitüsü İmmünobiyoloji ve Epigenetik için) HeLa hücreleri sağlamak için kabul.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
References
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
