Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo
Summary
O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.
Abstract
Nucleóides mitocondriais são partículas compactas formadas por moléculas de DNA mitocondrial revestidas de proteínas. O DNA mitocondrial codifica tRNAs, rRNAs e vários polipeptídeos mitocondriais essenciais. Os nucleóides mitocondriais dividem e distribuem dentro da dinâmica rede mitocondrial que sofre fissão/fusão e outras alterações morfológicas. Microscopia de fluorescência viva de alta resolução é uma técnica simples para caracterizar a posição e o movimento de um nucleóide. Para esta técnica, os nucleóides são comumente rotulados através de marcas fluorescentes de seus componentes proteicos, ou seja, fator de transcrição a (TFAM). No entanto, essa estratégia precisa de superexpressão de uma construção com etiqueta de proteína fluorescente, que pode causar artefatos (relatados para tfam), e não é viável em muitos casos. Corantes orgânicos de ligação de DNA não têm essas desvantagens. No entanto, eles sempre mostram a coloração de DNAs nucleares e mitocondriais, sem especificidade para os nucleóides mitocondriais. Levando em conta as propriedades físico-químicas desses corantes, selecionamos uma mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) e alcançamos rotulagem preferencial de nucleóides mitocondriais em células vivas. Propriedades do corante, particularmente seu alto brilho ao vincular ao DNA, permitem quantificação subsequente do movimento nucleóide mitocondrial usando séries temporais de imagens de iluminação estruturadas de super-resolução.
Introduction
Moléculas circulares de DNA de 16,5 kbp constituem o material genético das mitocôndrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs e 13 polipeptídeos necessários para complexos mitocondriais oxidativos de fosforilação. DNA mitocondrial ligado ao fator de transcrição mitocondrial a (TFAM) e várias outras proteínas formam os nucleóides mitocondriais1,,2,,3,,4. Os nucleóides mitocondriais movem-se e redistribuem entre os componentes da rede mitocondrial5,6 durante sua remodelagem morfológica, fissão ou fusão, dependendo da fase do ciclo celular, estresse e outros fatores (revisados em Pernas et al.7). Além disso, o movimento dos nucleóides mitocondriais está implicado na doença de lúpus eritematoso sistêmico8 e pode desempenhar um papel em outras doenças. A microscopia de fluorescência é uma técnica simples para estudos de células vivas de organelas, mas a técnica tem uma resolução de >200 nm, que é maior que o tamanho dos nucleóides mitocondriais (~100 nm9,,10,,11,12). Esse limite tem sido contornado pelas chamadas técnicas de “super-resolução”, como esgotamento estimulado de emissões (STED) e microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM)13,14. Até agora, nucleóides mitocondriais e outros DNAs foram imagens em células vivas por microscopia direta de reconstrução óptica estocástica (dSTORM)15. Estruturas submitocínias finas com posições correlacionadas com o dNH foram observadas por DST em células vivas16. No entanto, essas técnicas de super-resolução requerem alta intensidade de iluminação, o que causa efeitos fototóxicos nas células vivas17. Portanto, a imagem de lapso de tempo de nucleóides mitocondriais com resolução além do limite de difração é desafiadora. Para lidar com isso, utilizamos microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM)18. O SIM requer uma dose de energia de iluminação muito menor do que o STED e o SMLM19. Além disso, ao contrário das técnicas STED e SMLM, o SIM permite imagens tridimensionais multicoloridas simples (3D) e não requer propriedades fotofísicas particulares dos fluoroforos ou composição de tampão de imagem19.
A estratégia convencional para rotular nucleóides mitocondriais em células vivas é a marcação fluorescente de uma proteína nucleóide mitocondrial, como a TFAM20. No entanto, em muitos casos, essa estratégia não é adequada. Além disso, a superexpressão do TFAM com proteína fluorescente produz um artefato sério21. A rotulagem de DNA com corantes orgânicos tem vantagens sobre uma estratégia baseada em proteína fluorescente (FP). Os corantes orgânicos são livres de restrições relacionadas à marcação FP: podem ser usados para qualquer tipo de células ou tecidos e podem ser aplicados a qualquer momento de um experimento. Imagens de células vivas de nucleóides mitocondriais foram relatadas com vários corantes de ligação de DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,,25,26. Uma desvantagem substancial da maioria dos corantes de ligação de DNA para rotulagem nucleóide é que eles mancham todo o DNA dentro da célula. Direcionar um corante apenas para DNA mitocondrial é altamente desejável. Para isso, é necessária uma seleção cuidadosa de um corante que possua propriedades físico-químicas adequadas. Corantes lipofílicos que possuem carga positiva deslocalizada, como a rhodamina 123, são conhecidos por se acumularem em mitocôndrias vivas, que preservam seu potencial de membrana negativa. Além disso, um corante ideal para rotulagem específica de nucleóides mitocondriais deve ligar o DNA com alta afinidade e emitir fluorescência brilhante na ligação de DNA. Considerando esses requisitos, certas cianolinas são promissoras (por exemplo, picoGreen), mas o DNA nuclear é abundantemente manchado por esses corantes simultaneamente com DNA mitocondrial15,,25,26. O presente protocolo descreve a rotulagem específica de nucleóides mitocondriais em células vivas com outro corante de cianina, SYBR Gold (SG), e rastreamento dos nucleóides em vídeos SIM de super resolução de lapso de tempo. Além disso, as células vivas manchadas de SG podem ser imagens por qualquer tipo de microscópio fluorescente invertido (fusocal, disco giratório, epifluorescência, etc.) adequado para células vivas e equipado com uma fonte de luz de 488 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem vários componentes críticos no protocolo: Para alcançar a rotulagem preferencial do DNA mitocondrial, a concentração do corante de ligação de DNA durante a incubação deve ser mantida muito baixa (por exemplo, uma diluição de 1:10.000 de um estoque comercial típico), e o tempo de incubação deve ser de 30 minutos. O tempo de incubação nunca deve exceder 1 h. Deve-se usar o corante SYBR Gold; outros corantes de ligação de DNA não são brilhantes o suficiente para gerar um sinal forte ao rotular em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem Asifa Akhtar e Angelika Rambold (ambos do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética) por fornecer células HeLa.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
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