Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie
Summary
Het protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden met een commercieel verkrijgbare DNA-gel vlek, verwerving van time lapse-serie van live gelabelde cellen door super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM), en automatische tracking van nucleoïde beweging.
Abstract
Mitochondriale nucleoïden zijn compacte deeltjes gevormd door mitochondriale DNA-moleculen bedekt met eiwitten. Mitochondriaal DNA codeert tRNAs, rRNAs en verschillende essentiële mitochondriale polypeptiden. Mitochondriale nucleoïden verdelen en verspreiden binnen het dynamische mitochondriale netwerk dat splijting/fusie en andere morfologische veranderingen ondergaat. Hoge resolutie levende fluorescentie microscopie is een eenvoudige techniek om de positie en beweging van een nucleoïde te karakteriseren. Voor deze techniek worden nucleoïden vaak gelabeld door fluorescerende tags van hun eiwitcomponenten, namelijk transcriptiefactor a (TFAM). Echter, deze strategie moet overexpressie van een fluorescerende eiwit-tagged constructie, die artefacten kan veroorzaken (gemeld voor TFAM), en is niet haalbaar in veel gevallen. Organische DNA-bindende kleurstoffen hebben deze nadelen niet. Echter, ze tonen altijd vlekken van zowel nucleaire als mitochondriale AS, dus ontbreekt specificiteit voor mitochondriale nucleoids. Door rekening te houden met de fysisch-chemische eigenschappen van dergelijke kleurstoffen, hebben we een nucleïnezuurgelvlek (SYBR Gold) geselecteerd en een voorkeurslabel van mitochondriale nucleoïden in levende cellen bereikt. Eigenschappen van de kleurstof, met name de hoge helderheid bij binding aan DNA, maken latere kwantificering van mitochondriale nucleoïde beweging met behulp van tijdreeksen van super-resolutie gestructureerde verlichting beelden.
Introduction
Circulaire 16,5 kbp DNA-moleculen vormen het genetisch materiaal van mitochondriën, codering 22 tRNAs, 2 rRNAs, en 13 polypeptiden die nodig zijn voor mitochondriale oxidatieve fosforylation complexen. Mitochondriaal DNA gebonden aan mitochondriale transcriptie factor a (TFAM) en verschillende andere eiwitten vormen de mitochondriale nucleoïden1,2,,3,4. Mitochondriale nucleoïden bewegen en herverdelen tussen de componenten van het mitochondriale netwerk5,6 tijdens de morfologische remodellering, splijting of fusie, afhankelijk van de celcyclusfase, stress en andere factoren (beoordeeld in Pernas et al.7). Bovendien is de beweging van mitochondriale nucleoïden betrokken bij systemische lupus erythematosusziekte8 en kan een rol spelen bij andere ziekten. Fluorescentie microscopie is een eenvoudige techniek voor live-cel studies van organellen, maar de techniek heeft een resolutie van >200 nm, die groter is dan de grootte van mitochondriale nucleoïden (~ 100 nm9,10,11,12). Deze limiet is omzeild door zogenaamde “super-resolutie” technieken, zoals gestimuleerde emissie uitputting (STED) en single molecule lokalisatie microscopie (SMLM)13,14. Tot nu toe, mitochondriale nucleoïden en andere ED’s werden afgebeeld in levende cellen door directe stochastische optische reconstructie microscopie (dSTORM)15. Fijne sub-mitochondriale structuren met posities die correleren met mtDNA werden waargenomen door STED in levende cellen16. Deze superresolutietechnieken vereisen echter een hoge verlichtingsintensiteit, die fototoxische effecten op levende cellen17veroorzaakt. Daarom is time lapse imaging van mitochondriale nucleoïden met resolutie voorbij diffractielimiet een uitdaging. Om dit aan te pakken, gebruikten we super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM)18. SIM vereist een veel lagere dosis verlichtingsvermogen dan STED en SMLM19. Bovendien, in tegenstelling tot STED en SMLM technieken, SIM maakt eenvoudige multicolor driedimensionale (3D) imaging, en het vereist geen bijzondere fotofysische eigenschappen van de fluorofoforen of imaging buffer samenstelling19.
De conventionele strategie voor het labelen van mitochondriale nucleoïden in levende cellen is fluorescerende tagging van een mitochondriaal nucleoïde eiwit, zoals TFAM20. In veel gevallen is deze strategie echter niet geschikt. Bovendien, overexpressie van fluorescerende eiwit-tagged TFAM produceert een ernstige artefact21. Etikettering van DNA met organische kleurstoffen heeft voordelen ten opzichte van een fluorescerende eiwit (FP)-gebaseerde strategie. Organische kleurstoffen zijn vrij van beperkingen in verband met FP tagging: ze kunnen worden gebruikt voor elk type cellen of weefsels en kan worden toegepast op elk moment van een experiment. Live cel beeldvorming van mitochondriale nucleoïden is gemeld met verschillende DNA-bindende kleurstoffen: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, en picoGreen15,25,26. Een wezenlijk nadeel van de meeste DNA-bindende kleurstoffen voor nucleoïde etikettering is dat ze alle DNA in de cel bevlekken. Het richten van een kleurstof uitsluitend op mitochondriaal DNA is zeer wenselijk. Om dat te bereiken, is een zorgvuldige selectie van een kleurstof die geschikte fysisch-chemische eigenschappen bezit noodzakelijk. Lipofiele kleurstoffen die gedelokaliseerde positieve lading bezitten, zoals rhodamine 123, zijn bekend om zich te accumuleren in levende mitochondriën, die hun negatieve membraan potentieel behouden. Bovendien moet een ideale kleurstof voor specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden DNA met hoge affiniteit binden en heldere fluorescentie uitzenden op DNA-binding. Gezien deze eisen zijn bepaalde cyanines veelbelovend (bijvoorbeeld picoGreen), maar nucleair DNA wordt overvloedig gekleurd door deze kleurstoffen gelijktijdig met mitochondriaal DNA15,25,26. Het huidige protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden in levende cellen met een andere cyanine kleurstof, SYBR Gold (SG), en het bijhouden van de nucleoïden in time lapse super-resolutie SIM-video’s. Bovendien kunnen SG-gekleurde levende cellen worden afgebeeld door elk type omgekeerde fluorescerende microscoop (confocale, draaiende schijf, epifluorescentie, enz.) geschikt voor levende cellen en uitgerust met een 488 nm lichtbron.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritische componenten aan het protocol: Om preferentiële etikettering van mitochondriaal DNA te bereiken, moet de concentratie van de DNA-bindende kleurstof tijdens incubatie zeer laag worden gehouden (bijvoorbeeld een verdunning van 1:10.000 van een typisch handelsbestand) en de incubatietijd moet 30 min zijn. De incubatietijd mag nooit meer dan 1 uur bedragen. andere DNA-bindende kleurstoffen zijn niet helder genoeg om een sterk signaal te genereren bij het labelen bij een lage concentratie.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Asifa Akhtar en Angelika Rambold (zowel Max Planck Instituut voor Immunobiologie en Epigenetica) voor het verstrekken van HeLa cellen.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
References
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
