Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Summary

L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni umane, alla base del suo potenziale come biomarcatore. La metodologia di screening modulare e facile da implementare presentata in questo documento consente di selezionare specifiche sonde di acido nucleico per sfruttare l'attività nuclease come biomarcatore della malattia.

Abstract

Le nucleasi sono una classe di enzimi che scompongono gli acidi nucleici catalizzare l'idrolisi dei legami di fosforestro che legano gli zuccheri ribosio. Le nucleasi mostrano una varietà di ruoli fisiologici vitali negli organismi procariotici ed eucarioti, che vanno dal mantenimento della stabilità del genoma alla protezione contro gli agenti patogeni. L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni patologiche, tra cui infezioni batteriche e cancro. A tal fine, l'attività di nucleasi ha mostrato un grande potenziale per essere sfruttata come un biomarcatore specifico. Tuttavia, un metodo di screening robusto e riproducibile basato su questa attività rimane altamente auspicabile.

Qui, introduciamo un metodo che consente lo screening per l'attività nuclease utilizzando sonde di acido nucleico come substrati, con l'ambito di differenziare tra condizioni patologiche e sane. Questo metodo offre la possibilità di progettare nuove librerie di probe, con crescente specificità, in modo iterativo. Pertanto, sono necessari più cicli di screening per affinare il design delle sonde con caratteristiche migliorate, sfruttando la disponibilità di acidi nucleici modificati chimicamente. Il notevole potenziale della tecnologia proposta risiede nella sua flessibilità, alta riproducibilità e versatilità per lo screening dell'attività di nucleasi associata alle condizioni della malattia. Si prevede che questa tecnologia consentirà lo sviluppo di promettenti strumenti diagnostici con un grande potenziale nella clinica.

Introduction

Le nucleasi sono una classe di enzimi in grado di fendere i legami di fosforestro che formano la struttura della spina dorsale delle molecole di acido nucleico. La grande diversità di nucleasi rende la loro classificazione piuttosto difficile. Tuttavia, ci sono alcuni criteri comuni utilizzati per descrivere le nucleasi, come la preferenza del substrato (acido deossiribonucleico (DNA) o acido ribonucleico (RNA), sito di scissione (endonucleases o esonucleasi), o dipendenza da ioni onani metallici, tra gli altri¹. Le nucleasi sono enzimi catalitici altamente conservati che hanno ruoli fondamentali in entrambi gli organismi procariotici ed eucari....

Protocol

1. Progettazione e preparazione della libreria Oligonucleotide

1. Progettazione della libreria
   1. Sulla base dei seguenti criteri, progettare una libreria di sonde oligonucleotide dissedate tra 8 e 12-mer lunghe per evitare la formazione secondaria della struttura, con uguale lunghezza per tutte le sonde.
      1. Includere almeno un DNA e una sequenza casuale di RNA contenente una combinazione di adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T)/uracil (U) (sondedi DNA e RNA nella tabella 1 ).
         NOTA: Le sequenze di DNA e RNA descritte nella Tabella 1 sono state utili come substrati iniziali per classificare un tipo sco....

Results

La figura 1 mostra il flusso di lavoro di questa metodologia, suddivisa in due cicli di screening. Nel primo ciclo di screening, abbiamo utilizzato 5 sonde di DNA (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C e DNA Poly G) e anche 5 sonde di RNA (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C e RNA Poly G). I dati grezzi di questo ciclo di screening sono riportati nella tabella supplementari 1. Nel secondo round, le sonde modificate chimicamente sono state sintetizzate sostituendo la seq.......

Discussion

Le alterazioni dell'attività di nuclease sono state associate a un'ampia varietà di fenotipi della malattia, tra cui diversi tipi di cancro e infezioni batteriche. Queste alterazioni sono proposte come l'agente causale di una condizione¹⁴, mentre in altri casi sono la conseguenza di un evento fisiologico dannoso²⁰ o agente patogeno^16,26. Non sorprende che i tentativi di utilizzare nucleasi e attività di nucleasi com.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra a 96 pozzetti con fondo nero, non trattata,	Fisher Scientific	10000631
Cytation1	Provette BioTek	CYT1FAV
Eppendorf	Thermofisher	11926955
Escherichia coli	ATCC	25922
Fiala di conservazione criogenica Microbank contenente perle Pro-Lab	Diagnostics	22-286-155
Sonde per acidi nucleici	Biomers.net	#
Fosfato tampone Soluzione salina contenente MgCl2 e CaCl2	Gibco™
Salmonella enterica subs.	Enterica ATCC	14028
Tris-EDTA	Fisher Scientific	10647633
Triptone Soia Agar con sangue di pecora defibrato	Thermo Fisher Scientific	10362223
Brodo di Soia Trittico	Sigma Aldrich	22092