Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Summary

Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit verschiedenen menschlichen Bedingungen verbunden, die ihr Potenzial als Biomarker zugrunde liegen. Die modulare und einfach zu implementierende Screening-Methodik, die in diesem Papier vorgestellt wird, ermöglicht die Auswahl spezifischer Nukleinsäuresonden zur Nutzung der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten.

Abstract

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die Nukleinsäuren abbauen, indem sie die Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen katalysieren, die die Ribosezucker verbinden. Nukleasen weisen eine Vielzahl lebenswichtiger physiologischer Rollen in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen auf, die von der Aufrechterhaltung der Genomstabilität bis hin zum Schutz vor Krankheitserregern reichen. Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit mehreren pathologischen Bedingungen verbunden, einschließlich bakterieller Infektionen und Krebs. Zu diesem Zweck hat die Nukleaseaktivität ein großes Potenzial gezeigt, als spezifischer Biomarker genutzt zu werden. Ein robustes und reproduzierbares Screening-Verfahren auf der Grundlage dieser Aktivität ist jedoch nach wie vor sehr wünschenswert.

Hierin führen wir ein Verfahren ein, das das Screening auf Nukleaseaktivität mit Nukleinsäuresonden als Substraten ermöglicht, mit dem Umfang der Unterscheidung zwischen pathologischen und gesunden Bedingungen. Diese Methode bietet die Möglichkeit, neue Sondenbibliotheken mit zunehmender Spezifität iterativ zu gestalten. Daher sind mehrere Screening-Runden notwendig, um das Design der Sonden mit verbesserten Eigenschaften zu verfeinern und dabei die Verfügbarkeit chemisch modifizierter Nukleinsäuren zu nutzen. Das beträchtliche Potenzial der vorgeschlagenen Technologie liegt in ihrer Flexibilität, hohen Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit für das Screening von Nukleaseaktivitäten im Zusammenhang mit Krankheitszuständen. Es wird erwartet, dass diese Technologie die Entwicklung vielversprechender diagnostischer Werkzeuge mit großem Potenzial in der Klinik ermöglichen wird.

Introduction

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die in der Lage sind, die Phosphodiesterbindungen zu spalten, die die Rückgratstruktur von Nukleinsäuremolekülen bilden. Die große Vielfalt der Nukleasen macht ihre Klassifizierung ziemlich schwierig. Es gibt jedoch einige gängige Kriterien, die zur Beschreibung von Nukleasen verwendet werden, wie substratpräferenzium (Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA)), Spaltungsstelle (Endonukleasen oder Exonukleasen) oder Metallionenabhängigkeit, unter anderem¹. Nukleasen sind hochkonservierte katalytische Enzyme, die sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen eine grundlegendeRolle spielen und als Genbearbeitungswerkzeuge verwendet wurden und weiterhin verwendet werden 2 . Sie sind auch grundlegende Akteure in der DNA-Wartung und -Replikation, helfen, die Genomstabilität zu erhalten und nehmen an Korrekturverfahren teil³. Bei Bakterien wurden beispielsweise Nukleasen als wichtige Virulenzfaktoren identifiziert, die das überleben der Bakterien fördern können, indem sie die Wirksamkeit des^Immunsystemsdes Wirts 4^{,5,6,7 ,8}. Bei Säugetieren, Nukleasen wurden vorgeschlagen, in Apoptose⁹verwickelt werden , mitochondriale Biogenese und Wartung¹⁰ und Vermittlung von antibakteriellen und antiviralen angeborenen Immunantworten¹¹. Es überrascht nicht, dass Nuklease-Aktivitätsänderungen, ob Verbesserung oder Fehlen von, in eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten verwickelt sind. Diese Krankheiten reichen von einer Vielzahl von Krebsarten^12,13 bis zu Herzhypertrophie¹⁰ oder Autoimmunerkrankungen¹⁴. Daher sind Nukleasen zu interessanten Kandidaten als Biomarker für eine heterogene Gruppe menschlicher Bedingungen geworden. Tatsächlich haben Nukleasen bereits ihr Potenzial als erfolgreiche diagnostische Instrumente zum Nachweis von Infektionen gezeigt, die durch bestimmte bakterielle Wirkstoffe wie Staphylococcus aureus oder Escherichia coli¹⁵ verursacht werden. ¹⁶. Bei vielen Krebsarten ist die Expression von Staphylokokkennuklease-Domänen-haltigem Protein 1 (SND1) Ribonuklease ein Hinweis auf eine schlechte Prognose¹⁷. Bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden erhöhte Ribonuklease-I-Serumspiegel¹⁸ berichtet und vorgeschlagen, mit Krebszellphänotypen in Verbindung gebracht zu werden¹⁹. Bei ischämischen Herzerkrankungen, wie Myokardinfarkt oder instabiler Angina pectoris, desoxyribonuklease I (DNase I) Serumspiegel haben sich als ein gültiger diagnostischer Marker^20,21.

Es wurde vermutet, dass die globale Blaupause der Nuklease-Aktivität in gesunden und Krankheitszuständen unterschiedlich sein kann. Tatsächlich haben jüngste Berichte Unterschiede in der Nukleaseaktivität verwendet, um zwischen gesunden und krebsernen Phänotypen²² zu unterscheiden oder pathogene bakterielle Infektionen artspezifisch zu identifizieren^15,23. Diese Erkenntnisse haben einen neuen Weg für den Einsatz von Nukleasen als Biomarker von Krankheiten eröffnet. Daher besteht die Notwendigkeit für die Entwicklung einer umfassenden Screening-Methode, die in der Lage ist, krankheitsassoziierte Unterschiede in der Nukleaseaktivität systematisch zu identifizieren, die bei der Entwicklung neuer diagnostischer Instrumente von entscheidender Bedeutung sein können.

Hierin führen wir einen neuen In-vitro-Screening-Ansatz ein (Abbildung 1), um empfindliche und spezifische Sonden zu identifizieren, die in der Lage sind, zwischen Nukleaseaktivität bei gesunder und ungesundem Oder einer spezifischen Aktivität einer Zell- oder Bakterienart zu unterscheiden. Unter Ausnutzung der Modularität von Nukleinsäuren haben wir eine erste Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden entwickelt, die aus einem umfassenden Satz verschiedener Sequenzen und Chemikalien bestehen, die beide wichtige Parameter für die Bibliotheksgestaltung sind. Diese Oligonukleotid-Sonden werden von einem Fluorophor (Fluorescein-Amidit, FAM) und einem Quencher (Tide Quencher 2, TQ2) an den 5′ bzw. 3′ Enden(Tabelle 1) flankiert. Durch die Verwendung dieses fluoreszierenden Resonanzenergietransfers (FRET) basierenden fluormetrischen Assays zur Messung der Kinetik des enzymatischen Abbaus konnten wir Kandidatensonden mit dem Potenzial identifizieren, differentiale Muster der Nukleaseaktivität zu unterscheiden. mit gesunden oder Krankheitszuständen verbunden sind. Wir haben einen iterativen Prozess entwickelt, bei dem neue Bibliotheken auf der Grundlage der besten Kandidatensonden erstellt werden, der es ermöglicht, immer spezifischere Kandidatensonden in nachfolgenden Screening-Schritten zu identifizieren. Darüber hinaus nutzt dieser Ansatz die katalytische Natur von Nukleasen, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem die aktivierbare Natur der Reportersonden und die Fähigkeit von Nukleasen genutzt werden, Substratmoleküle kontinuierlich zu verarbeiten, die beide wichtige Vorteile gegenüber alternativen Antikörpern oder kleinen molekülbasierten Screening-Methoden darstellen.

Dieser Ansatz bietet ein hochmodulares, flexibles und einfach zu implementierendes Screening-Tool zur Identifizierung spezifischer Nukleinsäuresonden, die in der Lage sind, gesunde und krankheitsfördernde Erkrankungen zu unterscheiden, und eine hervorragende Plattform für die Entwicklung neuer diagnostische Nagenzwerkzeuge, die für zukünftige klinische Anwendungen angepasst werden können. Als solcher wurde dieser Ansatz verwendet, um die Nuklease-Aktivität von Salmonella Typhimurium (hier als Salmonellabezeichnet ) für die spezifische Identifizierung dieser Bakterien abgeleitet zu identifizieren. Im folgenden Protokoll berichten wir über eine Methode zum Abschirmen auf bakterielle Nukleaseaktivität mittels kinetischer Analyse.

Protocol

1. Oligonukleotid Bibliothek Design und Vorbereitung Bibliotheksdesign Basierend auf den folgenden Kriterien entwerfen Sie eine Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden zwischen 8 und 12-mer lang, um sekundäre Strukturbildung zu vermeiden, mit gleicher Länge für alle Sonden. Schließen Sie mindestens eine DNA- und eine RNA-Zufallssequenz ein, die eine Kombination aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T)/Uracil (U) enthält (DNA- und RNA-Sonden…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf dieser Methode, die in zwei Screening-Runden unterteilt ist. In der ersten Runde des Screenings verwendeten wir 5 DNA-Sonden (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C und DNA Poly G) sowie 5 RNA-Sonden (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C und RNA Poly G). Die Rohdaten dieser Screening-Runde sind in der Ergänzenden Tabelle 1 zu finden. In der zweiten Runde wurden chemisch modifizierte Sonden synthetisiert, indem die RNA-Sequenz durch che…

Discussion

Veränderungen der Nuklease-Aktivität wurden mit einer Vielzahl von Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht, einschließlich verschiedener Krebsarten und bakterieller Infektionen. Diese Veränderungen werden als Erreger einer Erkrankung¹⁴vorgeschlagen, während sie in anderen Fällen die Folge eines schädlichen physiologischen Ereignisses²⁰ oder des Pathogens^16,26sind. Es überrascht nicht, dass Versuche, Nuk…

Materials

Black bottom, non-treated 96 well plate	Fisher Scientific	10000631
Cytation1	BioTek	CYT1FAV
Eppendorf tubes	Thermofisher	11926955
Escherichia coli	ATCC	25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads	Pro-Lab Diagnostics	22-286-155
Nucleic acid probes	Biomers.net	#
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2	Gibco™	14040117
Salmonella enterica subs. Enterica	ATCC	14028
Tris-EDTA	Fisher Scientific	10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood	Thermo Fisher Scientific	10362223
Tryptic Soy Broth	Sigma Aldrich	22092