Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов
Summary
Измененная деятельность нуклеаза была связана с различными человеческими условиями, лежащими в основе ее потенциала в качестве биомаркера. Модульная и простая в ней методология скрининга, представленная в настоящем документе, позволяет подбирать специфические нуклеиновые кислотные зонды для использования нуклеаза в качестве биомаркера заболевания.
Abstract
Nucleases являются класс ферментов, которые расщепляют нуклеиновые кислоты путем катализирования гидролиза фосфодидерных связей, которые связывают рибоза сахара. Nucleases отображают различные жизненно важные физиологические роли в прокариотических и эукариотических организмов, начиная от поддержания стабильности генома для обеспечения защиты от патогенных микроорганизмов. Измененная активность нуклеаза была связана с несколькими патологическими состояниями, включая бактериальные инфекции и рак. С этой целью деятельность по нуклеаде показала большой потенциал для использования в качестве конкретного биомаркера. Однако надежный и воспроизводимый метод скрининга, основанный на этой деятельности, остается весьма желательным.
В этой связи мы внедряем метод, позволяющий проводить скрининг на нуклеализную деятельность с использованием зондов нуклеиновой кислоты в качестве субстратов с разновидностью между патологическими и здоровыми состояниями. Этот метод предлагает возможность проектирования новых библиотек зонда, с увеличением специфичности, в итеративной манере. Таким образом, несколько раундов скрининга необходимы для уточнения конструкции зондов с расширенными функциями, пользуясь наличием химически модифицированных нуклеиновых кислот. Значительный потенциал предлагаемой технологии заключается в ее гибкости, высокой воспроизводимости и универсальности скрининга активности нуклеаза, связанной с заболеваниями. Ожидается, что эта технология позволит разработать перспективные диагностические инструменты с большим потенциалом в клинике.
Introduction
Nucleases являются класс ферментов, способных расщепления фосфодиестерных связей, которые образуют основную структуру нуклеиновой кислоты молекул. Огромное разнообразие нуклеаз делает их классификацию довольно трудно. Тем не менее, Есть некоторые общие критерии, используемые для описания нуклеазы, такие как предпочтения субстрата (дезоксибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК)), расщепление сайта (эндонуклезаили или exonucleases), или ионной зависимости металла, среди других1. Nucleases являются высоко сохранены каталитические ферменты, которые имеют основные роли в обоих, прокариотических и эукариотических организмов и были использованы, и продолжают использоваться, как инструменты редактирования генов2. Они также являются основополагающими действующими лицами в поддержании ДНК и репликации, помогая сохранить стабильность генома и участвуя в процессах проверки чтения3. В бактериях, например, нуклеазы были определены в качестве важных факторов вирулентности, способных способствовать выживаемости бактерий за счет снижения эффективности иммунной системы хозяина4,5,6,7 ,8. У млекопитающих, нуклеазы были предложены быть вовлечены в апоптоз9, митохондриальный биогенез и содержание10 и посредничество антибактериальных и противовирусных врожденных иммунных ответов11. Неудивительно, что изменения активности нуклеаза, будь то повышение или отсутствие, были вовлечены в широкий спектр заболеваний человека. Эти заболевания варьируются от широкого спектра раковых заболеваний12,13 до сердечной гипертрофии10 или аутоиммунных заболеваний14. Таким образом, нуклеазы стали интересными кандидатами в качестве биомаркеров для неоднородной группы человеческих условий. В самом деле, nucleases уже показали свой потенциал в качестве успешных диагностических инструментов для выявления инфекций, вызванных конкретными бактериальными агентами, такими как золотистый стафилококк или Escherichia coli15, 16. Во многих типах рака, выражение стафилококковой нуклеи домен-содержащих белков 1 (SND1) рибонуклеазы свидетельствует о плохой прогноз17. У больных раком поджелудочной железы, повышенный рибонуклеаI (RNase I) сыворотки были зарегистрированы18 и предлагается быть связаны с раковыми фенотипами клеток19. В ишемических условиях сердца, таких как инфаркт миокарда или нестабильный стенокардия pectoris, дезоксирибонуклея I (DNase I) уровни сыворотки были показаны, чтобы быть действительным диагностическим маркером20,21.
Было высказывано что глобальный план деятельности nuclease может быть по-разному в здоровых и положениях заболевания. В самом деле, последние доклады использовали различия в активности нуклеаза различать здоровые и раковые фенотипы22 или для выявления патогенных бактериальных инфекций в видов-специфических образом15,23. Эти выводы открыли новый путь для использования нуклеаз в качестве биомаркеров болезни. Поэтому существует необходимость в разработке комплексного метода скрининга, способного систематически выявлять связанные с заболеваниями различия в деятельности нуклеаза, которые могут иметь ключевое значение при разработке новых диагностических средств.
В этом виде мы вводим и описываем новый подход к скринингу in vitro(рисунок 1)для выявления чувствительных и специфических зондов, способных дискриминировать деятельность нуклеазы в здоровой и нездоровой, или деятельность, характерную для типа клеток или бактерий. Воспользовавшись модульностью нуклеиевых кислот, мы разработали начальную библиотеку утоленных флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, состоящих из всеобъемлющего набора различных последовательностей и химии, оба являющиеся важными параметрами для оформления библиотеки. Эти олигонуклеотидные зонды окружены флюорофором (флуоресцеин амидитом, FAM) и утоляжем (tide quencher 2, T’2) на 5′ и 3′ заканчивается соответственно (Таблица 1). С помощью этого флуоресцентного резонанса передачи энергии (FRET) на основе флюорометрического исследования для измерения кинетики ферментативной деградации, мы смогли определить кандидат зондов с потенциалом для дискриминации дифференциальных моделей нуклеаза деятельности связанных со здоровыми или болезнями. Мы разработали итеративный процесс, в котором создаются новые библиотеки на основе лучших зондов-кандидатов, что позволяет идентифицировать все более конкретные кандидаты зондов в последующих шагах скрининга. Кроме того, этот подход использует каталитический характер нуклеаз для повышения чувствительности. Это достигается за счет использования активируемого характера репортер зондов и способность nucleases постоянно обрабатывать молекулы субстрата, как представляющие ключевые преимущества по сравнению с альтернативными антителами или малых молекул на основе методов скрининга.
Этот подход предлагает весьма модульный, гибкий и простой в реализации инструмент скрининга для идентификации конкретных зондов нуклеиновой кислоты, способных различать здоровые и болезни, и отличную платформу для разработки новых диагностические инструменты, которые могут быть адаптированы для будущих клинических применений. Таким образом, этот подход был использован для выявления нуклеаза деятельности, полученных от Salmonella Typhimurium (здесь называют salmonella) для конкретной идентификации этой бактерии. В следующем протоколе мы сообщаем о методе проверки на бактериальную активность нуклеаза с помощью кинетической экспертизы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изменения активности нуклеаны были связаны с широким спектром фенотипов заболеваний, в ключая различные виды рака и бактериальных инфекций. Эти изменения предлагается быть возбудителем состояния14, в то время как в других случаях они являются следствием пагубного физиоло…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Луису И. Эрнандес (Университет Линчепинга) за ее тщательный пересмотр рукописи и ценные советы. Эта работа была поддержана Фондом Кнута и Алисы Валленберг и Шведским правительством по стратегическим исследованиям в области материаловедения по перспективным функциональным материалам в Университете Линчепинга (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No 2009-00971).
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
Riferimenti
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Biologia dello sviluppo. 429 (1), 1-11 (2017).
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. . Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins – harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
