Kinetisk screening av Nukleasaktivitet med hjälp av Nukleinsyrprober
Summary
Förändrad nukleasaktivitet har förknippats med olika mänskliga tillstånd, underliggande dess potential som en biomarkör. Den modulära och lätt att genomföra screening metodik som presenteras i detta dokument kan valet av specifika nukleinsyra sonder för att utnyttja nukleasaktivitet som en biomarkör för sjukdom.
Abstract
Nukleaser är en klass av enzymer som bryter ner nukleinsyror genom att katalysera hydrolys av fosfodiester obligationer som länkar ribose socker. Nukleaser uppvisar en mängd vitala fysiologiska roller i prokaryota och eukaryotiska organismer, allt från att upprätthålla genomstabilitet till att ge skydd mot patogener. Förändrad nukleasaktivitet har förknippats med flera sjukdomstillstånd inklusive bakteriella infektioner och cancer. För detta ändamål har nukleasaktiviteten visat stor potential att utnyttjas som en specifik biomarkör. En robust och reproducerbar screeningmetod baserad på denna verksamhet är dock fortfarande mycket önskvärd.
Häri introducerar vi en metod som möjliggör screening för nukleasaktivitet med hjälp av nukleinsyrliga sonder som substrat, med omfattningen av differentiering mellan patologiska och hälsosamma tillstånd. Denna metod ger möjlighet att utforma nya sond bibliotek, med ökande specificitet, på ett iterativt sätt. Således, flera omgångar av screening är nödvändiga för att förfina sonderna design med förbättrade funktioner, att dra nytta av tillgängligheten av kemiskt modifierade nukleinsyror. Den föreslagna teknikens avsevärda potential ligger i dess flexibilitet, höga reproducerbarhet och mångsidighet för screening av nukleasaktivitet i samband med sjukdomstillstånd. Det förväntas att denna teknik kommer att möjliggöra utveckling av lovande diagnostiska verktyg med en stor potential i kliniken.
Introduction
Nukleaser är en klass av enzymer som kan klyva de fosfodiester obligationer som utgör ryggraden struktur av nukleinsyra molekyler. Den stora mångfalden av nukleaser gör deras klassificering ganska svårt. Emellertid, det finns några gemensamma kriterier som används för att beskriva nukleaser, såsom substrat preferens (deoxyribonukleinsyra (DNA) eller ribonukleinsyra (RNA)), klyvning webbplats (endonukleaser eller exonukleases), eller metall Jon beroende, bland annat1. Nukleaser är mycket bevarade katalytiska enzymer som har grundläggande roller i både, prokaryota och eukaryota organismer och har använts, och fortsätter att användas, som gen redigeringsverktyg2. De är också grundläggande aktörer i DNA-underhåll och replikering, hjälper till att hålla genom stabilitet och deltar i korrekturläsning processer3. I bakterier, till exempel, har nukleaser identifierats som viktiga virulensfaktorer, kunna främja bakteriell överlevnad genom att minska effekten av värdens immunsystem4,5,6,7 ,8. Hos däggdjur har nukleaser föreslagits vara inblandade i apoptos9, mitokondriell biogenes och underhåll10 och medling av antibakteriella och antivirala medfödda immunsvar11. Inte överraskande, Nuclease aktivitet förändringar, vare förbättring eller brist på, har varit inblandade i ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar. Dessa sjukdomar varierar från en mängd olika cancer12,13 till hjärthypertrofi10 eller autoimmuna sjukdomar14. Därför har nukleaser blivit intressanta kandidater som biomarkörer för en heterogen grupp av mänskliga förhållanden. I själva verket, nukleaser har redan visat sin potential som framgångsrika diagnostiska verktyg för detektion av infektioner orsakade av specifika bakteriella agenter, såsom Staphylococcus aureus eller Escherichia coli15, 16. i många cancertyper, uttryck av staphylococcal Nuclease domän innehållande protein 1 (SND1) ribonukleas är indikativt för dålig prognos17. I pankreascancer patienter, förhöjda ribonukleas i (RNase i) serumnivåer har rapporterats18 och föreslog att associeras med cancerogena cell fenotyper19. I ischemiska hjärttillstånd, såsom hjärtinfarkt eller instabil angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumnivåer har visat sig vara en giltig diagnostisk markör20,21.
Det har varit en hypotes om att den globala blåkopia av nukleasaktivitet kan vara olika i friska och sjukdomstillstånd. I själva verket har de senaste rapporterna använt skillnader i nukleasaktivitet för att skilja mellan friska och cancerogena fenotyper22 eller för att identifiera patogena bakteriella infektioner på ett artspecifikt sätt15,23. Dessa fynd har öppnat en ny aveny för användning av nukleaser som biomarkörer för sjukdom. Därför finns det en nödvändighet för att utveckla en heltäckande screeningmetod som systematiskt kan identifiera sjukdomsrelaterade skillnader i nukleasaktivitet, vilket kanske är av avgörande betydelse för utvecklingen av nya diagnostiska verktyg.
Häri introducerar och beskriver vi en ny in vitro-screeningmetod (figur 1) för att identifiera känsliga och specifika sonder som kan diskriminera mellan nukleasaktivitet i friska och ohälsosamma, eller aktivitet som är specifik för en typ av cell eller bakterier. Med utnyttjande av modularitet av nukleinsyror, designade vi ett första bibliotek av kylda fluorescerande oligonukleotid sonder bestående av en omfattande uppsättning av olika sekvenser och kemiska sammansättningar, båda är viktiga parametrar för biblioteks design. Dessa oligonukleotidsonder flankeras av en fluorophore (fluorescein amidite, FAM) och en törstsläckare (Tide törstsläckare TQ2) vid 5 ‘ och 3 ‘ ändarna respektive (tabell 1). Genom att använda denna fluorescerande resonans energiöverföring (FRET) baserade fluorometriska analysen för att mäta kinetiken av enzymatisk nedbrytning, kunde vi identifiera kandidat sonder med potential att diskriminera differential mönster av nukleasaktivitet associerade med friska eller sjukdomstillstånd. Vi utformade en iterativ process, där nya bibliotek skapas baserat på de bästa kandidaten sonderna, som gör det möjligt att identifiera allt mer specifika kandidat prober i efterföljande screening steg. Dessutom, detta tillvägagångssätt utnyttjar den katalytiska karaktären av nukleaser för att öka känsligheten. Detta uppnås genom att utnyttja den activatable karaktären av reportern sonder och förmågan hos nukleaser att kontinuerligt bearbeta substrat molekyler, båda representerar viktiga fördelar jämfört med alternativa antikroppar eller små molekyl-baserade screeningmetoder.
Detta tillvägagångssätt erbjuder ett mycket modulärt, flexibelt och lätt att genomföra screening verktyg för identifiering av specifika nukleinsyrliga sonder som kan diskriminera mellan friska och sjukdomstillstånd, och en utmärkt plattform för utveckling av nya diagnostiska verktyg som kan anpassas för framtida kliniska tillämpningar. Som sådan, detta tillvägagångssätt användes för att identifiera Nuclease verksamhet som härrör från salmonella typhimurium (häri kallad salmonella) för den specifika identifieringen av denna bakterie. I följande protokoll rapporterar vi om en metod för att avskärma för bakteriell nukleasaktivitet med hjälp av kinetisk analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förändringar av nukleasaktivitet har förknippats med en mängd olika sjukdoms fenotyper, inklusive olika typer av cancer och bakteriella infektioner. Dessa förändringar föreslås vara smittämnen av ett tillstånd14, medan de i andra fall är följden av en skadlig fysiologisk händelse20 eller patogena medel16,26. Inte överraskande, försök att använda nukleaser och nukleasaktivitet som en diagnostisk biom…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Luiza I. Hernandez (Linköpings universitet) för hennes noggranna revidering av manuskriptet och värdefulla råd. Detta arbete stöddes av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse och statens strategiska forskningsområde i materialvetenskap om avancerade funktionella material vid Linköpings universitet (fakultets bidraget SFO-mat-LiU nr 2009-00971).
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
Riferimenti
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Biologia dello sviluppo. 429 (1), 1-11 (2017).
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. . Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins – harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
