Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Çift Alan Yüksek Yoğunluklu Kayıt için Kurtarılabilir Opto-Silikon Prob ve Tetrode ile Hibrid Microdrive Sistemi

Published: August 10, 2019 doi: 10.3791/60028
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Psychiatry, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde iki beyin bölgesinde dokuz bağımsız olarak ayarlanabilir tetrode ve bir ayarlanabilir opto-silikon probu implantasyonu sağlayan bir hibrid microdrive dizisinin yapımını açıklar. Ayrıca güvenli bir şekilde kurtarma ve birden fazla amaç için opto-silikon probu yeniden kullanmak için bir yöntemdir gösterilmiştir.

Abstract

Çok bölgesel nöral kayıtlar, birden fazla beyin bölgesi arasındaki ince zaman ölçeğietkileşimlerini anlamak için önemli bilgiler sağlayabilir. Ancak, geleneksel mikrosürücü tasarımları genellikle tek veya birden fazla bölgeden kaydetmek için tek bir elektrot türünün kullanılmasına izin vererek tek birimli veya derinlikprofil kayıtlarının verimini sınırlar. Ayrıca genellikle yol ve / veya hücre tipi belirli aktivite hedef optogenetik araçları ile elektrot kayıtları birleştirmek için yeteneği sınırlar. Burada sunulan serbestçe hareket eden fareler için bir hibrid microdrive dizi verim ve üretim ve microdrive dizi yeniden bir açıklama optimize etmektir. Mevcut tasarım dokuz tetrodes ve serbestçe hareket eden fareler de aynı anda iki farklı beyin alanlarına implante bir opto-silikon prob kullanır. Tetrodes ve opto-silikon prob bağımsız birim ve salınım faaliyetlerinin verimi maksimize etmek için beyinde dorsoventral eksen boyunca ayarlanabilir. Bu mikrosürücü dizisi aynı zamanda uzun menzilli nöral devrelerin bölgesel veya hücre tipine özgü tepkilerini ve işlevlerini araştırmak için optogenetik manipülasyona aracılık eden ışık için bir kurulum da içerir. Buna ek olarak, opto-silikon prob güvenli bir şekilde kurtarılabilir ve her deneyden sonra yeniden kullanılabilir. Microdrive dizisi 3D baskılı parçalardan oluştuğundan, mikro sürücülerin tasarımı çeşitli ayarları barındıracak şekilde kolayca değiştirilebilir. İlk açıklanan mikrosürücü dizisinin tasarımı ve optogenetik deneyler için bir silikon prob optik fiber eklemek için nasıl, tetrode demeti ve bir fare beynine dizi implantasyonu imalatı izledi. Optogenetik stimülasyonla birlikte yerel alan potansiyellerinin ve birim spikingin kaydedilmesi, serbestçe hareket eden farelerde mikrosürücü dizi sisteminin fizibilitesini de göstermektedir.

Introduction

Farklı beyin bölgelerinin birbirleriyle nasıl dinamik olarak etkileşime girebildiğini araştırarak, nöronal aktivitenin öğrenme ve hafıza gibi bilişsel süreci nasıl desteklediğini anlamak çok önemlidir. Bilişsel görevlerin altında yatan nöral aktivitedinamiklerini açıklamak için, büyük ölçekli hücre dışı elektrofizyoloji mikrosürücüdizileri1 ,2,3yardımı ile serbestçe hareket eden hayvanlarda yapılmıştır, 4 . Son yirmi yılda, mikrosürücü dizi çeşitli fareler için birden fazla beyin bölgelerine elektrotlar implant geliştirilmiştir5,6,7,8 ve fareler9, 10.000 , 11.11.20 , 12. Bununla birlikte, mevcut mikrosürücü tasarımları genellikle birden fazla prob türünün kullanımına izin vermez, araştırmacıları belirli yararları ve sınırlamaları olan tek bir elektrot türünü seçmeye zorlar. Örneğin, tetrode dizileri dorsal hipokampus CA1gibiyoğun nüfuslu beyin bölgeleri için iyi çalışır1 ,13, silikon problar anatomik bağlantıları incelemek için daha iyi bir geometrik profil vermek ise14 , 15. yıl.

Tetrodes ve silikon problar genellikle in vivo kronik kayıt için kullanılır, ve her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Tetrodes maliyet etkinliği ve mekanik sertlik ek olarak, tek elektrotlar16,17daha iyi tek birim izolasyon önemli avantajları olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca microdrives8,18,19,20ile kombine edildiğinde tek birim faaliyetlerinin daha yüksek verim sağlar. Nöral devrelerin işlevini anlamak için aynı anda kaydedilen nöronların sayısını artırmak esastır21. Örneğin, zamana bağlı22 veya 23 hücreyi ödüllendirmek gibi işlevsel olarak heterojen hücre türlerinin küçük popülasyonlarını araştırmak için çok sayıda hücre gerekir. Başak dizilerinin kod çözme kalitesini artırmak için çok daha yüksek hücre numaraları gereklidir13,24,25.

Tetrodes, ancak, mekansal olarak dağıtılmış hücreleri kayıt bir dezavantaj var, korteks veya talamus gibi. Tetrodes aksine, silikon problar mekansal dağıtım ve yerel alan potansiyelleri etkileşim sağlayabilir (LPS) ve yerel bir yapı içinde spiking faaliyetleri14,26. Çok saplı silikon problar kayıt sitelerinin sayısını daha da artırır ve tek veya komşu yapılar arasında kayıt sağlar27. Ancak, bu tür diziler tetrodes göre elektrot sitelerinin konumlandırma daha az esnektir. Buna ek olarak, karmaşık başak sıralama algoritmaları tetrodes28,29,30tarafından elde edilen verileri yansıtmak için komşu kanalların eylem potansiyelleri hakkında bilgi ayıklamak için yüksek yoğunluklu problar gereklidir. Bu nedenle, tek birimlerin genel verim genellikle tetrodes daha azdır. Ayrıca, silikon problar kırılganlık ları ve yüksek maliyeti nedeniyle dezavantajlıdır. Bu nedenle, tetrodes vs silikon probların seçimi kayıt amacına bağlıdır, hangi kayıt sitelerinde tek birim veya mekansal profilleme yüksek verim elde edilmesi öncelikli olup olmadığı bir sorudur.

Nöral aktivite kayıt ek olarak, optogenetik manipülasyon belirli hücre tipleri ve / veya yolların nöral devrefonksiyonları 13,31katkıda nasıl incelemek için nörolojidaha güçlü araçlardan biri haline gelmiştir, 32,33. Ancak, optogenetik deneyler uyarım ışık kaynaklarına fiber konektör eklemek için mikrosürücü dizi tasarımı ek dikkate gerektirir34,35,36. Genellikle, fiber optik bağlantı beyinde sonda mekanik bir kayma yol açabilir nispeten büyük bir kuvvet gerektirir. Bu nedenle, geleneksel microdrive dizileri için implante edilebilir bir optik fiber birleştirmek için önemsiz bir görev değildir.

Yukarıdaki nedenlerden dolayı, araştırmacıların elektrot türünü optimize etmesi veya kaydın amacına bağlı olarak optik fiber yerleştirmeleri gerekmektedir. Örneğin tetrodes hipokampus daha yüksek birim verim elde etmek için kullanılır1,13, silikon problar kortikal alanların laminar derinlik profilini araştırmak için kullanılır, medial entorinal korteks gibi (MEC)37. Şu anda, tetrodes ve silikon probların eşzamanlı implantasyonu için mikrosürücüler sıçanlar için bildirilmişti5,11. Ancak, mikrosürücülerin ağırlığı, fare başında sınırlı alan ve farklı problar istihdam etmek için mikrosürücünün tasarımı için mekansal gereksinimler nedeniyle farelere birden fazla tetrode ve silikon prob yerleştirmek son derece zordur. Bir mikrosürücü olmadan silikon problar implant mümkün olmasına rağmen, Bu prosedür prob ayarı için izin vermez ve silikon-prob kurtarma başarı oranını düşürür12,38. Ayrıca, optogenetik deneyler microdrive dizi tasarımı ek hususlar gerektirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde kronik kayıt için bir mikrosürücü dizisinin nasıl inşa edilip yerleştirilebildiğini göstermektedir, bu da dokuz bağımsız olarak ayarlanabilir tetrode ve bir ayarlanabilir opto-silikon probun implantasyonuna olanak sağlar. Bu mikrosürücü dizisi aynı zamanda optogenetik deneyleri ve silikon sondanın kurtarılmasını da kolaylaştırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Mikrosürücü dizi parçalarının hazırlıkları

  1. Mikrosürücü dizi parçalarını diş modeli reizini kullanarak 3D yazıcı kullanarak yazdırın (Şekil1A,B). Yazdırılan parçalardaki küçük delikleri açık ve uygulanabilir tutmak için tek tek 3B yazdırılan katmanların kalınlığının 50 μm'den az olduğundan emin olun.
    NOT: Mikrosürücü dizisi beş bölümden oluşur (Şekil1C):(1) tetrodes için dokuz mikrosürücü vidası ve bir silikon prob için bir vida içeren mikrosürücü dizisinin ana gövdesi (Şekil1Ca-d). Alttaki opto-silikon probu için tetrode demeti ve deliğin koordinasyonu hedef beyin bölgesinin koordinatlarına bağlıdır (Şekil 1Cd); (2) bir silikon prob veya optrode takmak için bir mekik (Şekil 1Ce); (3) silikon prob konektörü tutmak için bir prob elektrik konektörü montaj (Şekil 1Cf); (4) bir optik fiber konektör takılı / fişi zaman implante opto-silikon probu istenmeyen hareketlerini önlemek için vücudun orta kısmına kelepçeler bir fiber ferrule tutucu (Şekil1Cg); ve (5) kararlı kayıt için mikrosürücü dizisine fiziksel ve elektrik kalkanı sağlayan bir kalkan konisi (Şekil 1Ch). Mikrosürücü dizisinin toplam ağırlığı 5,9 g olup, kalkan konisi de dahil olmak üzere (Tablo1). Baskılı parçalarda delikler tıkanmışsa, delikleri matkap uçları kullanarak delin: iç delikler için #76 ve tetrode-mikrodrive vidalar için dış delikler için #68, tetrode mikrosürücü vidalı destekçi deliği için #71 ve alttaki kılavuz direkleri için delikler için #77 vücut.
  2. Kılavuz gönderilerinin microdrive dizi gövdesine yerleştirilmesi.
    1. 26-Ga paslanmaz çelik tel iki 16 mm uzunlukları kesin. Döner öğütücü kullanarak tel uçlarını hafifçe keskinleştirin.
    2. Telleri gövdenin alt deliklerine yerleştirin(Şekil 2A). Kılavuz mesajları güvenli vücudun alt kısmında siyanoakrilat tutkal küçük bir miktar uygulayın.

2. Opto-silikon probu hazırlama

  1. Mikro sürücü vidasını silikon sonda için hazırlayın.
    NOT: Silikon prob için mikrosürücü vidası özel bir vida (300 μm pitch), bir destek tüpü destekleyen ve L şeklinde bir tüp (Şekil2B)oluşur.
    1. Kalıbı mikrosürücü kafası için hazırlayın (Şekil2C). Kalıbı oluşturmak için, mikrosürücünün 3D baskılı plastik deseni hazırlayın (Şekil2Ca). Sonra, desen etrafında bantlar koyarak bir temporal duvar yaptıktan sonra sıvı silikon jel dökün. Hafifçe sallayarak hava kabarcıkları çıkarın, tedavi olana kadar bekleyin, sonra desen silikon jel kalıp kaldırmak (Şekil2Cb).
    2. Döner öğütücü kullanarak 18 mm ve 9,5 mm uzunluğunda 23 G paslanmaz tel kesin. Diş akrilik yapışmasını artırmak için bir döner öğütücü ile tellerin üst 2-3 mm pürüzlü.
    3. Bir özel vida alın ve diş akrilik ile sürtünmeazaltmak için silikon yağı küçük miktarda uygulayın. Telleri ve özel vidayı kalıba ayarlayın.
    4. Teller ve vidalar etrafında hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için bir şırınga kullanarak kalıp içine diş akrilik dökün. Hava kabarcığı kirlenmesi mikrosürücüyü kırılgan hale getirecektir. Diş akrilik tamamen tedavi olana kadar bekleyin, sonra kalıp mikrosürücü vidaları çıkarmak. 6 mm'lik uzun tel ucunu, persleri kullanarak 60° açıya bükün.
    5. Vidayı döndürmek için mikrosürücü vidalarının (örn. çatlaklar, hava kabarcıkları ve sürtünme) kalitesini kontrol edin. Yüksek sürtünme varsa, onlar microdrive vida ile çiftler özelleştirilmiş bir sürücü ucu ile bir elektrikli vida lı sürücü kullanarak pürüzsüz hale gelene kadar vida döndürün.
    6. Mikrosürücü vidasını microdrive dizi gövdesine tutarak vidayı ters çevirip hareket etmediğini kontrol edin. Vidanın iplikleri, vida nın gövde deliğine takılması otomatik olarak oluşturulur.
  2. Mekiği hazırlayın (Şekil 3Aa).
    1. Keskin makas kullanarak iki 5 mm uzunlukta polyetheretherketone (PEEK) borusu kesin. Tüpleri mekiğin her iki tarafına hizalayın. Tutkal tüpler ve mekik epoksi kullanarak.
    2. Kılavuz gönderilere az miktarda silikon yağı uygulayın. Microdrive dizi gövdesinin kılavuz direklerine ekleyerek mekiğin kalitesini kontrol edin. Mekiğin aşırı sürtünme olmadan sorunsuz hareket edin.
  3. Bir optorode(Şekil 3Ab)hazırlayın. Optogenetik deney gerekli değilse bu adım atlanabilir.
    1. Bir yakut kesici kullanarak optik fiberi 21 mm uzunluğa kadar ayırın. Ucu düz ve parlak yapmak için lif ucu grind.
    2. Optik fiberi silikon sondanın ön tarafına yavaşça yerleştirin. Elyaf ucu elektrot sitelerinin üst kısmından 200-300 m yukarıda konumlandırılır. Elyafı şeffaf bantla geçici olarak tutun.
    3. Optik fiberi az miktarda epoksi kullanarak silikon sondanın tabanına yapıştırın. Epoksi tamamen iyileşene kadar en az 5 saat bekleyin.
      NOT: Optik fiberin elektrot sitelerine aynı tarafa takılması tavsiye edilir. Fiberin arka tarafa takılması ışığın kayıt alanlarını düzgün bir şekilde aydınlatmasını engelleyebilir.
  4. Mekiği silikon sondasına takın (Şekil 3Ac): silikon sondanın tabanının arkasına az miktarda epoksi uygulayın. Mekiğin alt kısmını silikon sondanın tabanına takın ve epoksinin ilk kürü sırasında mekik ile silikon sonda tabanı arasında bir boşluk oluşmasını önlemek için 2-3 dakika pozisyonda yavaşça tutun. Epoksi tamamen iyileşene kadar en az 5 saat bekleyin.
  5. Mekik tüplerini mikroskop altında ana gövdenin kılavuz direklerine dikkatlice yerleştirin (Şekil3B). Bu işlem sırasında, ince cımbız ile mekiğin oluğunu tutun.
  6. Vidayı çevirerek mikrosürücü vidasını vida deliğine takın. L şeklindeki telin ucunu mekik kafasının oluğuna yerleştirerek silikon probu ve mikrosürücü vidasını devreye sokun (Şekil3C).
  7. Prob elektrik bağlayıcısı tutucuyu mikrosürücü dizi gövdesine takın (Şekil3D).
    1. İki #0 vidayı 3,5 mm iplik uzunluğuna kadar kesin. Çapakkaldırmak için ipuçları grind.
    2. Sonda bağlayıcısı tutucuyu gövdeye yerleştirin. Silikon probu elektrik konektörünü tutucuya yerleştirin.
    3. Epoksi kullanarak tutucudaki silikon prob konektörünü sabitleyin ve silikon probun geri kazanım prosedürüne izin vermek için mikrosürücü dizi gövdesine yapıştırmamaya özen. Prob bağlayıcısı tutucuyu tutmak için vidaları takın.
  8. Ferrule tutucuyu opto-silikon prob ve mikrosürücü dizi gövdesine takın (Şekil3D).
    1. 6 mm iplik uzunluğuna kadar iki #0 vida kesin. Çapakkaldırmak için ipuçları grind.
    2. Ağırlığı ve alanı azaltmak için 2,5-3,0 mm dış çapı ile küçük hex somunyapmak için iki #0 makine vida lı somundışında grind.
    3. Vidaları tutucunun A bileşenine takın. Vida başlarını epoksi kullanarak yapıştırın.
    4. Vücutla sürtünmeyi azaltmak için A ve B bileşenine az miktarda silikon gres uygulayın. Bileşen A'yı vücuda takın, sonra ters cımbız kullanarak zamansal olarak tutun.
    5. B bileşenini A bileşeninin vidalarına yerleştirin. Vidalar içine özelleştirilmiş somun iplik. Vücutta ferrule tutucu güvenli fındık sıkın pliers kullanın.
    6. Fiber ferrule'yi lif ferrule tutucunun (Bileşen B) oluğuna takın. Lif feritin tutucudan 4-5 mm dışarı çıktığından emin olun.
    7. Ferrule ve tutucu oluk arasında az miktarda epoksi uygulayın. Epoksi tamamen iyileşene kadar bekleyin ve ferrule hareket etmez kontrol edin. Mikrosürücü vidasını çevirmeden önce somunları gevşeterek mekiği ve ferrule tutucuyu kontrol edin.
    8. Sondanın çalışma mesafesini kontrol edin. Mekik tüpleri hala kılavuz direkler ile ilişkili iken ferrule-holder üst konumda olduğunda sonda ucu tamamen vücuda geri çekilir emin olun. Maksimum çalışma mesafesi silikon sondasının uzunluğu ve hedef beyin bölgesi ile belirlenir.
    9. Microdrive-vida gevşek ise, destek için daha fazla iplik eklemek için vida etrafında diş akrilik küçük miktarda uygulayın. Tedavi edildiğinde, sıkılık ve stabiliteyi kontrol etmek için vidayı döndürün.

3. Tetrode hazırlama

NOT: Bu yordam daha önce yayınlanmış makaleler8,19,20,39benzer .

  1. Tetrode için mikrosürücü vidaları hazırlayın. Bir tetrode için mikrosürücü özel olarak işlenmiş vida ve 23 G boru (Şekil2B)oluşur. Bu yordam bölüm 2.1 benzer.
  2. Içinde 5,5 mil tel olan 30 G paslanmaz çelik boru bir paket olun. Bu durumda toplam dokuz adet 30 G boru (sekiz kayıt tetrodu ve bir referans elektrot) kullanıldı.
  3. 30 G desteyi sürücü gövdesinin altından geçirin ve ana gövdeye 20 G ince duvarlı boruyla sabitleyin. Ucunu eşit yapmak ve floş yapmak için bir döner öğütücü ile paketin alt kırpın. 30 G tüpün üst kısmını döner öğütücüyle kırpın, böylece 30 G tüp ana gövdeden yaklaşık 0,5 mm dışarı çıkar.
  4. 30 G boru içine 5,5 mil poliimid yalıtım tüpleri yükleyin. Tetrode telleri hazırlayın ve 32 kanallı bir elektrik arayüz kartına (EIB) yükleyin. Son hassas kesimden önce empedans test edenle elektrik bağlantısını kontrol edin.
  5. Alt elektrot ucu empedansı altın kaplama çözeltisi ile 250-350 kΩ'ye kadar dır. Superglue ile tüm tetrodes düzeltin.
  6. Sızdırmazlık ve yağlama için poliimid tüp ve tetrode ile mineral yağ arasındaki aşırı boşluğu doldurun. Yer kablosunu AyB'ye yönlendirin.
    NOT: Gerekirse optik fiber tetrode teller ilerler12ile entegre edilebilir.

4. Kalkan konisinin takılması

  1. Baskılı koninin iç üzerine gümüş iletken kalkan boyası boyayın. Mikrosürücü dizisini koninin içine yerleştirin (Şekil3E).
  2. İki #0 vidayı 3,5 mm iplik uzunluğuna kadar kesin. Mikrosürücü dizisini yerinde tutmak için vidaları koninin dışından sabitle.
  3. Elektrikli elektrik zemin ile kalkan koni bağlamak için vida başının etrafında gümüş boya uygulayın. Zemin teli ve koni arasındaki elektrik bağlantısını kontrol edin. Güvenli bir şekilde vücut eklemek için microdrive dizi gövdesi ve koruma konisi arasında epoksi küçük bir miktar uygulayın.
    NOT: Kalkan konisini hazırlamanın bir diğer yolu da alüminyum bant40 (Şekil3F)kullanmaktır. İlk olarak, alüminyum folyoyu kağıda yapıştırdıktan sonra kalkan koni için desen kağıdını hazırlayın (Şekil3Fa). Sonra, kağıt rulo ve siyanoakrilat tutkal küçük bir miktar kullanarak microdrive gövdeye takın (Şekil3Fb). Bu koninin ağırlığı 0,72 g'dır ve mikrosürücü dizisinin toplam ağırlığı4,7 g'a düşürülür (Tablo 1).

5. İmplant cerrahisi

NOT: Bu yordam, çift alan implantasyonu için daha önce yayınlanmış18,39,41 makalelerinden değiştirilmiştir. Ameliyat sonrası daha hızlı iyileşme için mikrosürücü implantı için hayvanın ağırlığının 25 g'ın üzerinde olduğundan emin olun.

  1. Hazırlık
    1. Bir zemin vida hazırlamak için, bir kafatası vida için gümüş tel takın ve gümüş boya uygulayın. Daha sonra, gümüş boya kullanarak telin karşı tarafına altın bir iğne takın.
    2. Microdrive dizisini stereotaktik bir aygıtta tutmak için sürücü tutma adaptörlerini hazırlayın. Epoksi kullanarak paslanmaz bir kolu bir erkek konektör takın. Konektörün ve paslanmaz tutamacın hizalanmasının düz olduğundan emin olun.
    3. Kayıt tan sonra histolojik doğrulamanın gerekli olması durumunda, silikon probu38'intetrodelerine veya arka tarafına Di-I uygulayın.
    4. Silikon probu istenilen derinlikte aşağı indirin. Ferrule tutucunun somunlarını çerçeveler kullanarak gevşetin, silikon probun mikrosürücü vidasını çevirerek silikon probu (opto-silikon probu) düşürün, sonra ferrule tutucuyu sabitlemek için somunları sabitlayın. Hipokampal alan CA1'e tetrode ve MEC'de silikon sonda yerleştirirken, tetrode kanül ile silikon sondanın ucu arasındaki mesafe 3-4 mm'dir.
  2. Stereotaksik bir cihazda anestezili fareyi (%0,8-%1,5 izofluran) ayarlayın. Farenin anestezik durumu ayak-çimdik refleks yokluğu ile doğrulanır. Kurumasını önlemek için gözlere açık merhem uygulayın. Güçlü cerrahi ışığa maruz kalmaktan korumak için gözleri bir folyo parçası ile kaplayın.
  3. Kürk tıraş sonra iyot ve izopropanol ile farenin kafa derisi dezenfekte. Standart cerrahi makas kullanarak kafa derisinde 1,5-2,0 cm'lik bir kesi yapın ve lidokain uyguladıktan sonra pamuklu bezler kullanarak kafatası üzerindeki dokuyu çıkarın.
  4. Fare kafasını stereotaksik araçla hizala. Bregma ve lambda arasındaki yükseklik farkının 100 μm'den az olduğundan emin olun. Bir atlas kullanarak kraniyotomi yerini belirleyin ve sterilize bir kalem ile bu yerleri işaretleyin.
  5. Kafatası vidalarını (0,8 mm çap, 0,200 mm iplik perdesi) kafatasıüzerinde 1,5 dönüş (0,3 mm) döndürerek, 0,5 mm matkap ucu kullanarak kafatasında 8-11 delik açtıktan sonra cerrahi cımbız ve tornavida kullanarak sabitleyin.
    NOT: Frontal kafatasında 2-4 delik, parietal kafatasının her iki tarafında 2-3 delik ve interparietal kafatasında 1-2 delik önerilmektedir.
  6. Zemin vidasını interparietal kemikte bir delik açtıktan sonra bir dönüş (0,2 mm) döndürerek deliğe takın. Bu deliğin kemikten beyin kasasına girmediğinden emin olun; aksi takdirde, serebellar sinyalleri kayıt kontamine olacaktır. Empedans, empedans ölçer kullanarak zemin vidası ile kafatası vidaları arasında 1 kHz'de 20 kΩ'den daha az olup olmadığını kontrol edin.
    NOT: Daha büyük empedans kayıt sırasında hareket yapıtlarının tanıtılmasına neden olur.
  7. İşaretli yerlerde kraniyotomi yapın. Dura farelerde bozulmadan bırakılabilir.
  8. Zemin vidasının erkek pimini ve mikrosürücü dizisinin yer konektörünü bağlayın. Zemin vida ve koruma arasında ölçerek empedans metre kullanarak bağlantı kontrol edin.
  9. Mikrosürücü dizisini bağdaştırıcıya ayarlayın, stereotaksik aygıta ayarlayın ve silikon probu istenilen derinliğe kadar yavaşça indirin. Silikon sonda sıyrık beyne takıldığında tetrode demetlerinin beyin yüzeyinin üzerine, ancak yine de mikrosürücü dizisinin içine yerleştirildiğinden emin olun (Şekil4A).
  10. Silikon probun alanını ve tetrode demeti (Şekil4B)için silikon yağı dikkatlice uygulayın. 20 G iğnenin ucuna silikon yağıküçük bir miktar koyun ve iğne yi kullanarak probların etrafına yağ uygulayın. Silikon gres, diş akrilik elektrotlar / problar üzerine veya altında akmayacak şekilde prob çevresindeki alanı tamamen kaplayana kadar tekrarlayın. Gres elektrot siteleri dokunmak izin vermemeye dikkat edin, aksi takdirde önemli ölçüde kayıt sitelerinin empedans artacaktır.
  11. Kafatasında demirleme vidaları için microdrive dizi düzeltmek için diş akrilik uygulayın.
    NOT: Bu akrilik kür sırasında üretilen aşırı ısı önlemek için üç katmanda diş akrilik uygulanması tavsiye edilir.
  12. Adaptörü mikrosürücü dizisinden dikkatle çıkarın. Dehidratasyonu önlemek için 1 mL PBS deri altı enjekte edin. Analjezik tedavi olarak 5 mg/kg meloksikam deri altı enjekte edin.
  13. Silikon probu konektörünü, elektrik bağlantılarının içine herhangi bir kir girmesini önlemek için bir bant parçası ile kapatın. Plastik bir parafin filmi kullanarak mikrosürücü dizisini kapatın ve yerine bantlayın.
  14. Uygun analjezik tedaviyi 3 gün boyunca uygulayın (örn. günde bir kez 2 mg/kg meloksikam deri altı enjeksiyonları). Tetrode ayarı başlamadan önce kurtarma için 3-5 gün bekleyin. Kurtarma döneminden sonra implante edilen fare Şekil 4C'degösterilmiştir.

6. Silikon probukurtarma (Şekil 4D)

  1. Ketamin (75 mg/kg) ve deksmetandonmidin (1 mg/kg) anestezikleri intraperitoneal olarak enjekte edin ve ayak ucurrefleksinin yokluğu doğrulanmadı. Bir başlık kullanarak kalp üzerinden% 4 paraformaldehit doğrudan perfüzyon tarafından anestezili fare düzeltin. Kemirgenler için cerrahi yöntemler daha önceaçıklanan 42.
  2. Bir plier kullanarak ferrule tutucunun somunlarını gevşetin. Daha sonra, silikon probu tamamen microdrive dizi gövdesinin içine doğru geri çekmek için ayar vidası çevirerek dikkatle vücudun üst kısmında hareket ettirin. Sondayı en üst konumda tutmak için somunları sabitle.
  3. Fare beynini yandan kafatasını kırarak alttan çıkar. Mikrosürücü dizisi artık hayvandan ayrıldı.
  4. Silikon probu yönlendiren L şeklindeki mikro sürücü vidasını tamamen çıkarın. Gevşetin ve ferrule tutucunun somunlarını pliers kullanarak çıkar. Ferrule tutucunun A bileşenini çıkar.
  5. Prob konektör yuvasını sökün ve sürücü gövdesinden ayırın. Prob konektör yuvasının mikrosürücü dizi gövdesinden çıkıp çıkamayabileceğini kontrol edin.
  6. Mekiğin üst kısmını cımbızla tutun, ardından silikon sonda tertibatını mikrosürücü dizisinden dikkatlice dışarı doğru kaydırın.
  7. Prob ucunu kontakt lens temizleyicisiyle (önce enzimle, sonra %3 hidrojen peroksitle) en az 1 gün boyunca temizleyin. Mikroskop altında isopropanol pedleri kullanarak elektrot ucunu dikkatlice silin. Sondayı statik olmayan bir depolama kutusunda tutun.
    NOT: Mekik ve prob konektörü yuvası silikon probuna bağlı kalır ve bir sonraki implantasyonda yeniden kullanılabilir.
    NOT: Bazı silikon problar hidrojen peroksit ile tolere edilemez. Bu durumda, sadece proteolitik enzim içeren kontakt lens çözeltisini kullanın.
  8. Bir sonraki ameliyat için microdrive dizi vücut yeniden kullanmak için, ince uçlu matkaplar ve nippers bir arada kullanarak diş akrilik kaldırın. Sonra, aseton içine kaldırılan diş akrilik batırarak kafatası vidaları kurtarmak. Asetonun mikrosürücü dizisinin plastik kısımlarını eriteceğini unutmayın.
  9. Bir neşter kullanarak mikrosürücü gövdesi ve koruma konisi arasındaki epoksi çıkarın.
    NOT: Mikrosürücü kırılmamışsa, bir sonraki ameliyat için ek parça basılması gerekmez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Microdrive dizisi 5 gün içinde inşa edildi. Mikrosürücü hazırlama zaman çizelgesi Tablo2'de açıklanmıştır. Bu mikrosürücü kullanılarak, dokuz tetrodes ve bir silikon sonda hipokampal CA1 ve farenin MEC içine implante edildi [21 hafta eski/ 29 g vücut ağırlığı erkek pOxr1-Cre (C57BL/6 arka plan)], sırasıyla. Bu transgenik fare MEC tabaka III piramidal nöronlarda Cre ifade eder. Fareye elektrot implantından 10 hafta önce MEC'ye 200 nL AAV5-DIO-ChR2-YFP (titre: 7.7 x 1012 gc/mL) enjekte edildi. LP'ler düşük geçişli filtre (1-500 Hz) kullanılarak kaydedildi ve yüksek geçişli filtre (0,8-5 kHz) kullanılarak spiking birimleri tespit edildi. Lif konektörünün sonunda ölçülen 10,6 mW yoğunlukta 1 ms darbe genişliği kullanılarak ışık stimülasyonu (λ = 450 nm) yapıldı. Tetrode kaydı için referans elektrot özel bir tetrode tel kullanılarak beyaz madde yerleştirildi. Silikon sonda kaydıiçin referans sondanın en üst kanalı olarak ayarlandı.

Tetrode ayarı yapıldıktan sonra, davranışsal performans doğrusal bir pistte (Şekil5A)ve açık bir alanda (Şekil5B)test edilmiştir. Her iki deneyde de fare ~30 dk(Şekil 5Aa,b,c; Şekil 5Ba,b,c). Elektrofizyolojik sinyaller kayıt oturumu boyunca şiddetli hareketle ilgili gürültü olmadan başarıyla kaydedildi (Şekil5Ad,e; Şekil 5 Bd,e). Daha sonra, MEC'de CA1 43'e projelenen MEC tabakası III nöronlarını uyarmak için ışık stimülasyonu yapıldı (Şekil 6A). Fare uyurken tetrodve silikon probundan spontan spiking aktiviteleri (Şekil6B,C)ve LFP'ler (Şekil6D)kaydedildi. Tetrodekaydedilen LLP'ler büyük dalgalanma aktiviteleri göstererek, tüm tetrodların CA1 piramidal hücre tabakasının yakınında konumlandırıldığını düşündürmektedir. Işık kaynaklı duyarlı aktiviteler ilk olarak MEC'de gözlendi, ardından 13-18 ms gecikmeli CA1'de (Şekil6E)görüldü.

Figure 1
Şekil 1: Microdrive dizisine genel bakış. (A) Tetrode tarafında (a) ve silikon prob tarafında (b) mikrosürücü dizisinin iskelet görünümü. (B) Tetrode tarafında (a) ve silikon prob tarafında (b) görüntülenen yüklü mikrosürücü dizisinin gerçek bir görüntüsü. Microdrive dizisi panel (b) jig sahne yerleştirilir. (C) Tek tek 3D baskılı mikrosürücü dizi parçaları. (a-d) Dört farklı açıdan görüntülenen microdrive dizi gövdesi (a: tetrode yan görünüm; b: silikon-prob yan görünümü; c: üst görünüm; d: alt görünüm). Paneldeki kesik çizginin büyütülmüş görünümü (c) Şekil 2A'dagösterilmiştir. (e) Silikon sondasını tutan ve ayarlamaya izin veren mekik. Paneldeki kesik çizgiye (e) silikon prob iliştirilir. (f) 32 kanallı silikon prob konektörünü tutan prob konektörü tutucu. (g) Fiber konektörü ışık kaynağıyla takılırken/çekerken sondanın hareketini önlemek için optik fiber ferrule tutan fiber ferrule tutucu. Bu bölüm iki bileşenden oluşur: [panel (g) ve A ve B bileşenleri]. (h) İletken malzeme ile boyanırken fiziksel ve elektrik kalkanı sağlayan baskılı koruma konisi. Koni penceresi sonunda bant veya 3D baskılı malzeme bir parça ile kaplıdır mikrosürücü dizi hazırlama sırasında yapının içinde görmek için yeteneği sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ana gövdede kılavuz direklerin ve mikrosürücü vidalarının hazırlanması. (A) Kılavuz post-hazırlık. (a) Şekil 1Cc'de gösterilen mikrosürücü dizi gövdesinin büyütülmüş görünümü. (b) Vücudun deliklerine post-ekleme kılavuzu. (B) Mikro sürücü vidalı tasarımlar. (a) 300 μm pitch özel vida, destek tüpü ve L şeklinde tüp ten oluşan bir silikon prob için mikrosürücü vidası. (b) 160 μm pitch özel vida ve 30 G paslanmaz kılavuz tüpten oluşan bir tetrod için mikrosürücü vidası. (C) Mikrosürücü vidalarının üst parçasının imalatı: (a) Mikrosürücü vidası için anti-kalıbın 3D baskılı desenlerinin hazırlanması. Resim silikon-probu mikrosürücü vida için bir desen gösterir. (b) Anti-kalıp deseni (a) ve silikon-kauçuk malzeme kullanılarak yapılan kalıp. Monte edilmiş mikrosürücü vidaları özel vidalar ve teller/tüp takılarak ve her kuyuya diş akrilik dökülerek üretilir. Inset: kalıp kuyularının büyütülmüş görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Microdrive dizi montajı. (A) Opto-silikon probun hazırlanması. (a) Mekiğe iki plastik kılavuz tüp takmak. (b) Optik fiberi silikon sondasına yapıştırmak. (c) Mekiği opto-silikon sondaya takmak. Bu resimde, mekiğin alt kısmı (kesik çizgi) silikon sondanın tabanına [arka (b)] eklenir. Mekik ve silikon sonda sapı paralel olmalıdır. (B) Opto-silikon prob mekiği tertibatının mikrosürücü dizi gövdesinin kılavuz direklerine yüklenmesi. (C) Prob tamamen vücuda geri çekildiğinde ve sürücü gövdesinde (b) en düşük seviyede konumlandırıldığında silikon sonda mikrosürücünün göreceli konumu. L şeklindeki tel mekikteki oluğa yerleştirilir. (D) Fiber ferrule tutucu ve prob konektör monte bir patlamış görünümü. (E) Koruma konisi takılı. İletken malzeme koninin içine bodur içinde bodur. (F) Bir kağıt ve alüminyum bant kullanarak alternatif koruma konisi. (a) Desen kağıdı. (b) 3D baskılı sürüme göre 1,1 g ağırlığı azaltan ekli alternatif koruma konisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Ameliyat sırasında probların mühürlanması ve silikon probun geri kazanımı. (A) mikrosürücü dizi ve kraniyotomi sonrası fare kafatası, silikon gres uygulamadan önce. Silikon sonda şu anda beyne yaklaşık 2mm yerleştirilir. (B) Diş akrilik gelen probları korumak için silikon-prob ve tetrode demetleri etrafında silikon gres uygulayarak. (C) Kurtarma döneminden sonra, fare yürürken (a), tımar (b) ve karşı dengeleme kasnak sistemi (c) ile kayıt kablosuna bağlandığında kronik olarak implante edilmiş fare. (D) Kurtarılan silikon probu, (a) ve sonrası (b) temizleme çözeltisine daldırma. (a) deki biyolojik dokular temizleme işleminden sonra (b) çıkarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Hipokampal CA1 ve medial entorinal kortekste eşzamanlı tetrode/silikon-prob kaydı örnekleri (MEC) fareden. (A) Doğrusal yolda kayıt. (a) Yeniden kodlama için kullanılan doğrusal parça. (b) Pistte ~30 dk için fare keşif yörüngeleri. (c) Doğrusal yolda davranışsal performans. (d-e) Tetrod (d) ve silikon probu (e) temsilcisi LFP kayıtları. (B) Açık alanda kayıt. (a) Yeniden kodlama için kullanılan açık alan odası. (b) odada ~ 30 dk için fare keşif yörüngeleri. (c) Açık alanda davranışsal performans. (d,e) Tetrod (d) ve silikon probu (e) temsilcisi LFP kayıtları. LED, farenin konumlarını kaydetmek için baş amplifikatörüne takılır. Doğrusal pist ve açık alan haznesi elektrostatik gürültüyü azaltmak için elektrik zeminine bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: CA1 ve MEC'deki eşzamanlı kayıtların ve optogenetik stimülasyonun temsil sonuçları. (A) 4 haftalık enjeksiyondan sonra AAV5-DIO-ChR2-YFP ekspresyonu. MEC tabaka III piramidal nöronlar dorsal MEC dorsal CA1 kendi aksonları proje. Kesik çizgiler: ori, stratum oriens; pry, stratum pyramidale; rad, stratum radatum; mol, stratum lacunosum moleküler. (B) Tetrode'lardan birinden temsilci başak kaydı. (a) tetrode kaydedilen ani sivri 2B küme projeksiyonları. (b) (a) 'deki kesik çizgilerle gösterilen üç kümenin ortalama başak dalga formuörnekleri. (C) Silikon-probu elektrot sitelerinden birinden temsili başak kaydı. (a) başak ana bileşenlerinin 2B küme projeksiyonları. (b) Üç kümenin ortalama başak dalga formu örnekleri. Başak kümeleri (pembe ve yeşil) gürültü kümelerinden (mavi) ayrılır. (B,C) kümeleri KlustaKwik yazılımı kullanılarak hesaplanır. (D) CA1 (a) ve MEC (b)'deki silikon probundaki tetrodelerden aynı anda kaydedilen spontan LLP izleri. Siyah oklar (B) ve (C) gösterilen silikon-probu elektrot yerinde gösterilen tetrode gösterir. (E) CA1 (a) ve MEC (b) silikon prob tetrodes darbeli optik stimülasyon (10.6 mW, 1 ms; dolu kırmızı ok başı) lFP yanıtları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

gram/bir Numarası toplamı [gram]
ana gövde 1.25 1 1.25
Servis 0.04 1 0.04
prob konektörü montajı 0.19 1 0.19
fiber ferrule tutucu 0.1 1 0.1
kalkan konisi 1.82 1 1.82 (0.72)*
iletken macun 0.2 1 0.2
makine vidası (#00, 2 mm), EIB tutmak için 0.05 2 0.1
makine vidası (#0-80, 3,5 mm) 0.06 4 0.24
makine vidası (#0-80, 6mm) 0.09 2 0.18
Somun 0.03 2 0.06
mikrosürücü (tetrode) 0.05 9 0.45
mikrosürücü (silikon prob) 0.29 1 0.29
silikon prob 0.28 1 0.28
elektrikli arayüz kartı 0.6 1 0.6
Toplam 5.8 (4.7)*

Tablo 1: Her mikrosürücü dizisi parçasının ayrı ağırlığı. Mikrosürücü dizisinin toplam ağırlığı 5.9 g epoksi ile koruyucu koni sabitleme sonra (* bir kağıt ve alüminyum bant kullanarak alternatif bir koruma konisi kullanarak durumunda).

Yordam Zaman
mikrosürücü hazırlama
3B parça yazdırma 1 gün
optrode hazırlık
Mikrosürücü kafası için kalıbı hazırlayın 1 gün*
Microdrive kafa hazırlığı 3 saat
Optik fiber takma 3 saat
Mekik takma 3 saat
tetrode hazırlama
Mikrosürücü kafası için kalıbı hazırlayın 1 gün*
Microdrive kafaları hazırlama 3 saat
Tetrode tellerin yüklenmesi 1 gün
Kalkan konisinin takılması
Boyama koruma boyası geceleme*
Mikrosürücü gövdesine bağlanma 3 saat
* bu işlem paralel olarak yapılabilir

Tablo 2: Mikrosürücü hazırlığının zaman çizelgesi. 3D parçalı baskı, silikon kauçuk / diş akrilik / epoksi kür için bekleyen ve tetrode teller yükleme toplam 4-5 gün içinde, mikrosürücü dizi hazırlama zaman çoğunluğu alır.

Ek Dosyalar: Ek dosyalar, .sldprt ve .stl formatında beş mikrosürücü parçasının 3B model verilerini içerir. Orijinal 3D model dosyaları yazılım Solidworks2003 ile oluşturuldu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol, bağımsız ayarlanabilir tetrodelar ve serbestçe davranan farelerde silikon sonda kullanarak iki beyin alanından nöral aktivitelerin kaydedilmesine olanak tanıyan melez bir mikrosürücü dizisinin nasıl inşa edilip yerleştirilecek olduğunu gösteriyor. Ayrıca optogenetik deneyler ve deneylerden sonra silikon sonda kurtarma gösterir. Ayarlanabilir silikon probu33 veya opto-silikon probu36 implantasyonu daha önce farelerde gösterilmiş olsa da, bu protokol esnek sağlamak için eşzamanlı tetrode dizive opto-silikon probu implantasyonunda net avantajlara sahiptir implante prob tipleri seçimi. İmplante prob türü deney amacına bağlı olarak değiştirilebilir, multi-sap probları gibi27,44 veya ultra yoğunluklu Neuropixels21,45. Koordinasyon ve implantasyon açısı7 kolayca gerektiğinde 3D nesne tasarım aşamasında değiştirilebilir. Örneğin, çift site li ve hatta üç siteli kayıt hipokampus46gibi bellekle ilgili beyin yapıları arasında öğrenme görevleri sırasında mümkündür, entorinal korteks47, prefrontal korteks48, amigdala49, ve korteksi 50singulat .

Başarılı implant ve kayıt için birkaç kritik prosedür vardır. Silikon bazlı probların kırılganlığı nedeniyle, montaj sırasında mikrosürücü dizisine gelen mekanik titreşimler veya darbeler en aza indirilmelidir. Örneğin, silikon probu mikrosürücü dizisine yüklemeden önce bir matkap kullanarak tıkanmış deliklerin açılması tamamlanmalıdır. Ayrıca, kaydedilen verilerin stabilitesini sağlamak için mikrosürücü dizi yapımı ve implant cerrahisi sırasında her adımda zemin bağlantısını dikkatle kontrol etmek vurgulanmalıdır. Yere kararsız veya yüksek empedanslı bağlantılar, kayıt oturumu sırasında ağır gürültü ve hareketle ilgili yapılara neden olur. Stabil kayıtlar için, beyin dokusu implant cerrahisi nden olumsuz etkilendiği için elektrot sürüklenmesini önlemek için ameliyattan sonra 1-2 hafta beklemeniz önerilir. Ancak silikon probundaki sinyal kalitesi, önceki deneyimlere göre cerrahi travmadan 1-2 hafta sonra iyileşir. Diğer fareler tarafından implante edilen mikrosürücü dizisinin zarar görmesini önlemek için tek gövdeli kullanılması önerilir. Optogenetik deney için, en silikon-problar ışık stimülasyonu 51 yanıt olarakfotoğraf eserleri neden dikkat etmek önemlidir , diğerleri fotoğraf eserleri en aza indirmek için tasarlanmıştır52 (foto-artifon azaltılmış vardır ticari olarak kullanılabilir silikon problar).

Microdrive dizisinin ağırlığı (5,9 g) önceki makalelerde açıklanan tipik microdrives daha ağır12,53, esas microdrive dizi gövdesi nedeniyle (~ 21% toplam ağırlığı), koruma konisi (~ 31%), ve metal parçalar (vidalar ve fındık: ~22%). Yeterli vücut ağırlığına sahip fareler daha erken iyileşme eğiliminde olduğu için implant cerrahisi için25 g (~ 2-3 ay C57BL/6 fareler için 54,55)üzerinde ağırlıkları olan fareler kullanılması tavsiye edilir. Bu nedenle, bu mikrosürücü dizisi yavru fareler için en iyi çözüm olmayabilir. Farenin vücut ağırlığının %5-10'u olan cihazlar genellikle12,56 numaralı implantlar için tolere edilmeye yönlendirilirken (bu57için destekleyici yayınlanmış veri olmamasına rağmen), bu mikrosürücü dizisi vücut ağırlığının ~%24'ünü ağırlığındadır. 25 g fareler (~ 19% alternatif koni kullanırken aşağıda açıklanan).

Ancak, implante yetişkin fareler serbestçe hareket ve ev kafeslerinde etrafında atlamak başardık. Benzer bir mikrosürücü dizi ağırlığı (~ 4.5 g) ile implante Fareler daha önce davranışsal görev gerçekleştirmek için gösterilmiştir (lineer labirent görevi) gıda kısıtlaması altında bile13,17. Ağırlık dezavantajı kayıt sırasında bir sorun değildir, bir karşı ağırlık dengeleme sistemiolarak 18,34,58 veya başlık sistemi59 microdrive dizi destekleyecek. Buna ek olarak, mikrosürücü dizisinin toplam ağırlığı yüksekliği düşürerek veya kalkan koni kalınlığını azaltarak ve daha küçük vidalar kullanmak için tasarım değiştirerek azaltılabilir.

Mevcut 3B baskı malzemesi kullanılarak, kalkan konisinin kalınlığı ~0,3 mm'ye kadar (geçerli kalınlığı ~0,6 mm'den) düşürülebilir. Tetrode telleri hala kaplandığı sürece koni yüksekliği ~5 mm azaltılabilir. Tetrode kablolarının açığa çıkması tellerin kırılması ve uzun süreli kaydın arızalanmasına neden olur. Alternatif olarak, kağıt ve alüminyum bant kullanarak kalkan konisi hazırlanması ~ 0,7 g (~ 15% toplam ağırlığı; orijinal microdrive dizisinin toplam ağırlığı% 20 azaltılmış) koni ağırlığı azaltabilir; rağmen, bu fiziksel gücü ile bir tradeoff vardır. Buna ek olarak, mikrosürücünün boyutu (mevcut kalkan konisi: 4.2 x 4.0 x 2.6 cm = ana eksen x minör eksen x yüksekliği) hayvan kafesinin üstünden sağlandığı takdirde gıda ve su erişimine engel teşkil edebilir. Kafes zemininde veya yanaktan temin edildikleri sürece, mikrosürücü farelerin yeme, içme, tımar, yetiştirme veya yuvalama gibi doğal davranışlarını rahatsız etmez60.

Sonuç olarak, bu mikrosürücü protokolü araştırmacılara, uzun menzilli nöral devrelerin dinamiklerini ve işlevlerini anlamak için serbestçe hareket eden farelerde birden fazla beyin alanından kayıt için esnek seçenekler sunar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Japonya Bilim intidanSı Araştırma Burslarını Destekleme Derneği (HO), Donatılmış Bilgin Programı (TK), İnsan Sınırı Bilim Programı (TK), Beyin Araştırma Vakfı (TK), Fakülte Bilim ve Teknoloji Edinimi ve Tutma Programı (TK), Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı (TK) ve Sumitomo Vakfı Araştırma Hibe (JY), NARSAD Genç Araştırmacı Araştırma Grant (JY) tarafından. Makalenin hazırlanması sırasında değerli yorum ve öneriler için W. Marks teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#00-90 screw J.I. Morris #00-90-1/8 EIB screws
#0-80 nut Small Parts B00DGB7CT2 brass nut for holding fiber ferrule holder
#0-80 screw Small Parts B000FMZ57G brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone
22 Ga polyetheretherketone tubes Small Parts SLPT-22-24 for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter
23 Ga stainless tubing Small Parts HTX-23R for tetrode
23 Ga stainless wire Small Parts HTX-23R-24-10 for L-shape/support wire
26 Ga stainless wire Small Parts GWX-0200 for guide-posts
30 Ga stainless wire Small Parts HTX-30R for tetrode
3-D CAD software package Dassault Systèmes SolidWorks 2003
3D printer FormLab Form2
5.5mil polyimide insulating tubes HPC Medical 72113900001-012
aluminum foil tape Tyco Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape for the alternative shielding cone
conductive paste YSHIELD HSF54 for shielding cone
customized screws for silicon-probe microdrive AMT UNM1.25-HalfMoon half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch
customized screws for tetrode microdrive AMT Yamamoto_0000-160_9mm slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design
dental acrylic Stoelting 51459
dental model resin FormLab RS-F2-DMBE-02
Dremel rotary tool Dremel model 800 a grinder
drill bit Fine Science Tool 19007-05
electric interface board Neuralynx EIB-36-Narrow
epoxy Devcon GLU-735.90 5 minutes epoxy
eye ointment Dechra Puralube Ophthalmic Ointment to prevent mice eyes from drying during surgery
fiber polishing sheet Thorlabs LFG5P for polishing the optical fiber
fine tweezers Protech International 15-368 for loading/recovering the silicon probe
gold pins Neuralynx EIB Pins Small
ground wire A-M Systems 781500 0.010 inch bare silver wire
headstage preamp Neuralynx HS-36
impedance meter BAK electronics Model IMP-2 1 kHz testing frequency
mineral oil ZONA 36-105 for lubricating screws and wires
optical fiber Doric MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT
Recording system Neuralynx Digital Lynx 4SX
ruby fiber scribe Thorlabs S90R for cleaving the optical fiber
silicon grease Fine Science Tool 29051-45
silicon probe Neuronexus A1x32-Edge-5mm-20-177 Fig. 3, 4A, 4B, 5
silicon probe Neuronexus A1x32-6mm-50-177 Fig. 4C
silicon probe washing solution Alcon AL10078844 contact lens cleaner
silicone lubber Smooth-On Dragon Skin 10 FAST for preparation of microdrive mold
silver paint GC electronic 22-023 silver print II coating, used for ground wires
skull screw Otto Frei 2647-10AC 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch
standard surgical scissors ROBOZ RS-5880
stereotaxic apparatus Kopf Model 942
super glue Loctite LOC230992 for applying to guide-posts
surgical tweezers ROBOZ RS-5135
Tetrode Twister Jun Yamamoto TT-01
tetrode wires Sandvik PX000004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
  2. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. The Journal of Neuroscience. 16 (2), 823-835 (1996).
  3. Keating, J. G., Gerstein, G. L. A chronic multi-electrode microdrive for small animals. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 201-206 (2002).
  4. Winson, J. A compact micro-electrode assembly for recording from the freely moving rat. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 35 (2), 215-217 (1973).
  5. Michon, F., et al. Integration of silicon-based neural probes and micro-drive arrays for chronic recording of large populations of neurons in behaving animals. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046018 (2016).
  6. Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
  7. Billard, M. W., Bahari, F., Kimbugwe, J., Alloway, K. D., Gluckman, B. J. The systemDrive: a Multisite, Multiregion Microdrive with Independent Drive Axis Angling for Chronic Multimodal Systems Neuroscience Recordings in Freely Behaving Animals. eNeuro. 5 (6), (2018).
  8. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  9. Lu, P. L., et al. Microdrive with Two Independent Moveable Sets for Wide-Ranging, Multi-Site, Multi-Channel Brain Recordings. Journal of Medical and Biological Engineering. 34 (4), 341-346 (2014).
  10. Haiss, F., Butovas, S. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
  11. Headley, D. B., DeLucca, M. V., Haufler, D., Pare, D. Incorporating 3D-printing technology in the design of head-caps and electrode drives for recording neurons in multiple brain regions. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2721-2732 (2015).
  12. Voigts, J., Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: an ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8 (2013).
  13. Yamamoto, J., Tonegawa, S. Direct Medial Entorhinal Cortex Input to Hippocampal CA1 Is Crucial for Extended Quiet Awake Replay. Neuron. 96 (1), 217-227 (2017).
  14. Schomburg, E. W., et al. Theta phase segregation of input-specific gamma patterns in entorhinal-hippocampal networks. Neuron. 84 (2), 470-485 (2014).
  15. Fernandez-Ruiz, A., et al. Entorhinal-CA3 Dual-Input Control of Spike Timing in the Hippocampus by Theta-Gamma Coupling. Neuron. 93 (5), 1213-1226 (2017).
  16. Rey, H. G., Pedreira, C., Quian Quiroga, R. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119 (Pt B), 106-117 (2015).
  17. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. Journal of Neuroscience Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
  18. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
  19. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  20. Lu, L., Popeney, B., Dickman, J. D., Angelaki, D. E. Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  21. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  22. Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321 (5894), 1322-1327 (2008).
  23. Gauthier, J. L., Tank, D. W. A Dedicated Population for Reward Coding in the Hippocampus. Neuron. 99 (1), 179-193 (2018).
  24. Davidson, T. J., Kloosterman, F., Wilson, M. A. Hippocampal replay of extended experience. Neuron. 63 (4), 497-507 (2009).
  25. Gerwinn, S., Macke, J., Bethge, M. Bayesian population decoding of spiking neurons. Frontiers in Computational Neuroscience. 3, 21 (2009).
  26. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
  27. Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. Journal of Neurophysiology. 90 (2), 1314-1323 (2003).
  28. Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165-1174 (2016).
  29. Hilgen, G., et al. Unsupervised Spike Sorting for Large-Scale, High-Density Multielectrode Arrays. Cell Reports. 18 (10), 2521-2532 (2017).
  30. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  31. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
  32. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  33. Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
  34. Rangel Guerrero, D. K., Donnett, J. G., Csicsvari, J., Kovacs, K. A. Tetrode Recording from the Hippocampus of Behaving Mice Coupled with Four-Point-Irradiation Closed-Loop Optogenetics: A Technique to Study the Contribution of Hippocampal SWR Events to Learning. eNeuro. 5 (4), (2018).
  35. Liang, L., et al. Integrated and Quick-to-Assemble (SLIQ) Hyperdrives for Functional Circuit Dissection. Frontiers in Neural Circuits. 11, 8 (2017).
  36. Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7 (1), 2773 (2017).
  37. Quilichini, P., Sirota, A., Buzsaki, G. Intrinsic circuit organization and theta-gamma oscillation dynamics in the entorhinal cortex of the rat. The Journal of Neuroscience. 30 (33), 11128-11142 (2010).
  38. Sauer, J. F., Struber, M., Bartos, M. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  39. Shikano, Y., Sasaki, T., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  40. Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. Journal of Visualized Experiments. 91 (91), e51675 (2014).
  41. Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  43. Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal cortex layer III input to the hippocampus is crucial for temporal association memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
  44. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. The European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  45. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 92-100 (2018).
  46. Jones, M. W., Wilson, M. A. Theta rhythms coordinate hippocampal-prefrontal interactions in a spatial memory task. PLoS Biology. 3 (12), e402 (2005).
  47. Frank, L. M., Brown, E. N., Wilson, M. A. A comparison of the firing properties of putative excitatory and inhibitory neurons from CA1 and the entorhinal cortex. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 2029-2040 (2001).
  48. Kitamura, T., et al. Eng and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 356 (6333), 73-78 (2017).
  49. McGaugh, J. L., Cahill, L., Roozendaal, B. Involvement of the amygdala in memory storage: interaction with other brain systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13508-13514 (1996).
  50. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304 (5672), 881-883 (2004).
  51. Mikulovic, S., et al. On the photovoltaic effect in local field potential recordings. Neurophotonics. 3 (1), 015002 (2016).
  52. Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
  53. Meng, E., Hoang, T. MEMS-enabled implantable drug infusion pumps for laboratory animal research, preclinical, and clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (14), 1628-1638 (2012).
  54. Hu, S., et al. Dietary Fat, but Not Protein or Carbohydrate, Regulates Energy Intake and Causes Adiposity in Mice. Cell Metabolism. 28 (3), 415-431 (2018).
  55. Yang, Y., Smith, D. L. Jr, Keating, K. D., Allison, D. B., Nagy, T. R. Variations in body weight, food intake and body composition after long-term high-fat diet feeding in C57BL/6J mice. Obesity. 22 (10), 2147-2155 (2014).
  56. Morton, D. B., et al. Refinements in telemetry procedures. Seventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement, Part A. Laboratory Animals. 37 (4), 261-299 (2003).
  57. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  58. Lin, L., et al. Large-scale neural ensemble recording in the brains of freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 28-38 (2006).
  59. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
  60. Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).

Tags

Nörobilim Sayı 150 in vivo elektrofizyoloji kronik kayıt hibrid mikrosürücü dizisi tetrode kurtarılabilir opto-silikon prob optogenetik çok siteli kayıt serbestçe hareket eden fareler tek birim yerel alan potansiyeli dorsal hipokampus CA1 dorsal medial entorinal korteks
SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Çift Alan Yüksek Yoğunluklu Kayıt için Kurtarılabilir Opto-Silikon Prob ve Tetrode ile Hibrid Microdrive Sistemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto,… More

Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (150), e60028, doi:10.3791/60028 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter