Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption
Summary
Ici, nous présentons un protocole mécanique pour perturber la connexine de jonction d’écart 43 et mesurer l’impact ultérieur ceci a sur la biomécanique endothéliale par l’observation des tractions et des contraintes intercellulaires.
Abstract
Des cellules endothéliales ont été établies pour produire des contraintes et des tractions intercellulaires, mais les jonctions de fossé de rôle jouent dans le stress intercellulaire endothélial et la génération de traction sont actuellement inconnues. Par conséquent, nous présentons ici un protocole mécanique-basé pour sonder l’influence de connexin 43 de jonction d’écart (Cx43) a sur la biomécanique endothéliale en exposant des monocouches endotenoles à un inhibiteur connu de Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) et mesure de l’impact de cet inhibiteur sur les tractions et les contraintes intercellulaires. Nous présentons des résultats représentatifs, qui montrent une diminution des tractions et des contraintes intercellulaires sous une dose élevée de chalcone (2 g/mL) par rapport au contrôle. Ce protocole peut être appliqué non seulement à Cx43, mais aussi à d’autres jonctions d’écart, en supposant que l’inhibiteur approprié est utilisé. Nous croyons que ce protocole sera utile dans les domaines de la recherche cardiovasculaire et mécanobiologie.
Introduction
Le champ qui se réfère à l’étude des effets des forces physiques et des propriétés mécaniques sur la physiologie et la pathologie cellulaires et tissulaires est connu sous le nom de mécanobiologie1. Quelques techniques utiles qui ont été utilisées dans la mécanobiologie sont la microscopie de contrainte de monocouche et la microscopie de force de traction. La microscopie de force de traction permet le calcul des tractions générées à l’interface cellule-substrat, tandis que la microscopie de contrainte de monocouche permet le calcul des contraintes intercellulaires générées entre les cellules adjacentes dans une monocouche2 ,3,4,5,6. Les résultats obtenus à partir de méthodes antérieures ont suggéré que les contraintes mécaniques d’origine cellulaire jouent un rôle crucial dans la détermination du sort d’une foule de processus cellulaires3,4,5. Par exemple, lors de l’exposition à une force mécanique externe, un groupe de cellules qui migrent en tant que collectif peut modifier leur morphologie et polariser leur forme pour s’aligner et migrer le long de la direction de la force appliquée en générant, en partie, des tractions7, 8. Les tractions fournissent une mesure qui peut être utilisée pour évaluer la contractilité cellulaire et sont calculées à l’aide de la microscopie de force de traction (TFM). La microscopie de force de traction (TFM) commence par la détermination des déformations de substrats induites par les cellules suivies du calcul du champ de traction à l’aide d’une approche computationnelle mathématiquement rigoureuse et basée sur la mécanique. Depuis la capacité de calculer les tractions a été autour depuis un certain temps, les chercheurs ont utilisé TFM pour révéler l’impact des tractions ont sur une foule de processus, y compris le cancer9, la cicatrisation des plaies10 et l’évaluation de l’ingénierie cardiaque tissu11.
La mise en œuvre de TFM et de MSM ensemble peut être divisée en trois étapes essentielles qui doivent être exécutées dans l’ordre suivant : premièrement, les déformations d’hydrogel produites par les cellules sont déterminées ; deuxièmement, les tractions sont récupérées à partir de déformations hydrogel; et troisièmement, une approche d’élément fini est employée pour calculer les contraintes intercellulaires normales et de cisaillement dans le monocouche entier. Pour calculer les déplacements de gel, des images de perles de fluorescence avec des cellules ont été comparées à l’image de perle de référence (sans cellules) en utilisant une routine de vélocimétrie d’image de particule sur mesure (PIV). La taille et le chevauchement des fenêtres de corrélation croisée pour l’analyse PIV ont été choisis pour être de 32 x 32 pixels et 0,5, respectivement. À cette époque, les changements de pixels ont été convertis en microns en se multipliant avec un facteur de conversion pixel-micron (pour notre microscope, ce facteur de conversion est de 0,65) pour obtenir des déplacements dans les avions. Les erreurs associées à l’ignorance des déplacements hors avion sont négligeables12,13. Après le calcul des déplacements de gel, il y a deux types de mesures de traction qui peuvent être employées, tractions contraintes et tractions sans contrainte8,14. Les tractions sans contrainte fournissent le champ de traction pour l’ensemble du champ de vision (y compris les régions avec et sans cellules), tandis que les tractions contraintes fournissent le champ de traction uniquement pour les régions qui incluent les cellules14. Ensuite, les contraintes intercellulaires sont calculées à l’aide de la microscopie de contrainte monocouche (MSM), qui est une extension de la microscopie de force de traction. La mise en œuvre de MSM est basée sur l’hypothèse que les tractions locales exercées par une monocouche de cellules à l’interface cellule-substrat doivent être équilibrées par des forces mécaniques transmises entre les cellules à l’interface cellule-cellule comme l’exigent les lois de Newton7 ,12,13. Une hypothèse clé ici est que la monocouche cellulaire peut être traitée comme une mince feuille élastique parce que la distribution de traction dans la monocouche est connue et l’équilibre de force ne dépend pas des propriétés du matériau cellulaire. Une autre hypothèse clé est que les forces de traction sont équilibrées par des contraintes intercellulaires locales dans le champ de vision optique (dans le monocouche) et l’influence de cet équilibre de force est minime dans la région distale (en dehors de la monocouche)13. Par conséquent, les conditions limites définies par les contraintes intercellulaires, les déplacements ou une combinaison des deux à la limite de la monocouche sont cruciales pour effectuer MSM13. En tenant compte des informations ci-dessus, nous utilisons MSM pour effectuer une analyse d’éléments finis (FEM) pour récupérer le stress principal maximum(max) et le stress principal minimum(min)en faisant pivoter le plan de stress à chaque point dans le Monocouche. Ces contraintes principales sont ensuite utilisées pour calculer le stress intercellulaire normal moyen 2D [(max‘min) /2] et le stress intercellulaire maximum de cisaillement 2D [(max– min) /2] dans la monocouche entière 12,13. Cette procédure est décrite plus en détail par Tambe et al.12,13
La microscopie de contrainte monocouche (MSM) permet le calcul des contraintes intercellulaires de cellules-cellules générées dans un monolayer6,7,8,12,13. Ces contraintes intercellulaires ont été suggérées pour être importantes pour la croissance et la réparation de tissu, la guérison de blessure, et la métaste de cancer12,15,16,17. En outre, les contraintes intercellulaires ont été suggérées pour être également importantes dans la migration endothéliale de cellules et la fonction de barrière endothéliale17,18. Tandis que les jonctions de cellules-cellules telles que les jonctions serrées et les jonctions d’adhérents ont été suggérées pour jouer un rôle critique dans la génération et la transmission intercellulaires de stress endothélial, le rôle des jonctions d’écart demeure insaisissable. Les jonctions d’écart relient physiquement les cellules adjacentes et fournissent une voie pour que le courant électrique et les molécules (lt;1 KDa) passent entre les cellules voisines19,20,21. Bien que les cellules endothéliales expriment Cx37, Cx40, et Cx43 jonctions d’écart19,22, Cx43 est sans doute le plus important en termes de progression de la maladie23. L’évidence de l’importance de Cx43 peut être trouvée dans le fait que la suppression génétique de Cx43 chez les souris a des résultats dans l’hypotension24 et a des effets défavorables sur l’angiogenèse25. En outre, Cx43 a été documenté pour être important pour la migration cellulaire et la prolifération et dans la progression de l’athérosclérose18,22,23,24,25 .
Dans ce protocole, nous avons utilisé TFM et MSM pour étudier si la traction et la génération de stress intercellulaire dans le confluent, monolayer endothélial serait affectée par la perturbation de la jonction endothéliale de jonction d’écart Cx43. Nous avons perturbé Cx43 avec 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), une molécule documentée pour inhiber l’expression Cx4326. Chalcone a été utilisé pour perturber Cx43 au lieu de siRNA que le chalcone a été signalé précédemment par Lee et al. pour perturber l’expression Cx4326. En outre, nous avons été particulièrement intéressés par l’influence du chalcone sur l’endothélium car il a également été signalé comme étant un composé anti-inflammatoire et antiplaquettaire qui peut potentiellement être utilisé pour la prévention et le traitement de divers vasculaires pathologies26. Les traitements de Chalcone ont été exécutés une heure après le début de l’expérience, les monocouches chalcone-traités ont été imaged pendant un total de six heures, et le traitement d’image a été exécuté avec un code personnalisé de MATLAB pour déterminer des tractions et plus tard intercellulaire Souligne. Nos résultats ont montré une diminution globale des tractions et des contraintes intercellulaires, suggérant que Cx43 joue un rôle clé dans la biomécanique endothéliale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre groupe, ainsi que d’autres, a été avec succès l’aide de TFM et MSM pour sonder l’influence des jonctions cellules-cellules dans divers processus cellulaires pathologiques et physiologiques in vitro7,15,18,27 . Par exemple, Hardin et coll. ont présenté une étude très perspicace qui suggère que la transmission intercellulaire du stress guide la formation de lacunes paracellulaires d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage de l’Université de Floride centrale et le National Heart, Lung, And Blood Institute du National Institute of Health sous le prix K25HL132098.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
Riferimenti
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