Estudando remodelagem reversa ventricular esquerda por debandagem aórtica em roedores
Summary
Aqui descrevemos um protocolo passo-a-passo de desbandada cirúrgica de aorta no modelo de camundongos bem estabelecido de constrição aórtica. Este procedimento não só permite estudar os mecanismos subjacentes à remodelação reversa ventricular esquerda e à regressão da hipertrofia, mas também testar novas opções terapêuticas que possam acelerar a recuperação do miocárdio.
Abstract
Para entender melhor a remodelagem reversa ventricular esquerda (LV) (RR), descrevemos um modelo de roedor no qual, após a remodelação de LV induzida por banda aórtica, os ratos passam por RR após a remoção da constrição aórtica. Neste artigo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para realizar uma debandagem aórtica cirúrgica minimamente invasiva em camundongos. A ecocardiografia foi posteriormente utilizada para avaliar o grau de hipertrofia cardíaca e disfunção durante a remodelação de LV e RR e determinar o melhor tempo para a debandagem aórtica. Ao final do protocolo, foi realizada avaliação hemodinâmica terminal da função cardíaca e coleta de amostras para estudos histológicos. Mostramos que a debandada está associada a taxas de sobrevivência cirúrgica de 70-80%. Além disso, duas semanas após a debandada, a redução significativa da carga pós-onda ventricular desencadeia a regressão da hipertrofia ventricular (~20%) e fibrose (~26%), recuperação da disfunção diastólica avaliada pela normalização do preenchimento ventricular esquerdo e das pressões diastólicas finais (E/e’ e LVEDP). A debandagem aoórtica é um modelo experimental útil para estudar LV RR em roedores. A extensão da recuperação do miocárdio é variável entre os sujeitos, portanto, imitando a diversidade de RR que ocorre no contexto clínico, como a substituição da válvula aórtica. Concluímos que o modelo de banda/debandada aórtica representa uma ferramenta valiosa para desvendar novas percepções sobre os mecanismos da RR, ou seja, a regressão da hipertrofia cardíaca e a recuperação da disfunção diastólica.
Introduction
A constrição da aorta transversal ou ascendente no camundongo é um modelo experimental amplamente utilizado para hipertrofia cardíaca induzida por sobrecarga de pressão, disfunção diastólica e sistólica e insuficiência cardíaca1,2,3,4. A constrição aórtica inicialmente leva à hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo compensado (LV) para normalizar o estresse da parede1. No entanto, sob certas circunstâncias, como a sobrecarga cardíaca prolongada, essa hipertrofia é insuficiente para diminuir o estresse da parede, desencadeando disfunção diastólica e sistólica (hipertrofia patológica)5. Paralelamente, mudanças na matriz extracelular (ECM) levam à deposição do colágeno e à interligação em um processo conhecido como fibrose, que pode ser subdividido em fibrose de substituição e fibrose reativa. A fibrose é, na maioria dos casos, irreversível e compromete a recuperação do miocárdio após alívio de sobrecarga6,7. No entanto, estudos recentes de ressonância magnética cardíaca revelaram que a fibrose reativa é capaz de regredir a longo prazo8. Ao todo, fibrose, hipertrofia e disfunção cardíaca fazem parte de um processo conhecido como remodelagem do miocárdio que progride rapidamente para a insuficiência cardíaca (HF).
Compreender as características da remodelagem do miocárdio tornou-se um grande objetivo para limitar ou reverter sua progressão, esta última conhecida como remodelagem reversa (RR). O termo RR inclui qualquer alteração do miocárdio cronicamente revertida por uma dada intervenção, tal terapia farmacológica (por exemplo, medicação antihipertensiva), cirurgia de válvula (por exemplo, estenose aórtica) ou dispositivos de assistência ventricular (por exemplo, HF crônico). No entanto, a RR é frequentemente incompleta devido à hipertrofia predominante ou disfunção sistólica/diastólica. Assim, ainda faltam o esclarecimento dos mecanismos subjacentes da RR e novas estratégias terapêuticas, o que se deve principalmente à impossibilidade de acesso e estudo do tecido miocárdio humano durante a RR na maioria desses pacientes.
Para superar essa limitação, os modelos de roedores têm desempenhado um papel significativo no avanço da nossa compreensão das vias de sinalização envolvidas na progressão do HF. Especificamente, a debandagem aórtica de camundongos com constrição aórtica representa um modelo útil para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à remodelação adversa da LV9 e RR10,11, pois permite a coleta de amostras de miocárdio em diferentes pontos de tempo nessas duas fases. Além disso, fornece uma excelente configuração experimental para testar potenciais alvos novos que podem promover/acelerar o RR. Por exemplo, no contexto da estenose aórtica, este modelo pode fornecer informações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na vasta diversidade da resposta do miocárdio subjacente à (in)completude da RR6,12, bem como, o tempo ideal para a substituição da válvula, o que representa uma grande deficiência do conhecimento atual. De fato, o momento ideal para essa intervenção é objeto de debate, principalmente porque é definido com base na magnitude dos gradientes aórticos. Vários estudos defendem que este ponto de tempo pode ser tarde demais para a recuperação do miocárdio, pois fibrose e disfunção diastólica já estão frequentemente presentes12.
Pelo que sabemos, este é o único modelo animal que recapitula o processo de remodelação do miocárdio e RR em condições como estenose aórtica ou hipertensão antes e depois da substituição da válvula ou o início de medicamentos anti-hipertensivos, respectivamente.
Buscando enfrentar os desafios resumidos acima, descrevemos um modelo animal cirúrgico que pode ser implementado tanto em camundongos quanto em ratos, abordando as diferenças entre essas duas espécies. Descrevemos os principais passos e detalhes envolvidos na realização dessas cirurgias. Por fim, relatamos as mudanças mais significativas que ocorrem na LV imediatamente antes e em toda a RR.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo aqui proposto imita o processo de remodelação de LV e RR após banda aórtica e debandada, respectivamente. Portanto, representa um excelente modelo experimental para avançar nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos na remodelação adversa da LV e testar novas estratégias terapêuticas capazes de induzir a recuperação miocárdia desses pacientes. Este protocolo detalha passos sobre como criar um modelo animal roedor de banda aórtica e debandada com uma técnica cirúrgica minimamente…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à Fundação Portuguesa de Ciência e Tecnologia (FCT), União Europeia, Quadro de Referência Estratégica Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) pelo financiamento da unidade de pesquisa da UnIC (UID/IC/00051/2013). Este projeto é apoiado pela FEDER por meio do COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projeto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), apoiado pelo Programa Operacional Norte Portugal (NORTE 2020), sob o acordo de parceria Portugal 2020, por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF), o projeto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), apoiado pelos Fundos Estruturais e de Investimento Europeus, programa operacional regional de Lisboa 2020. Daniela Miranda-Silva e Patrícia Rodrigues são financiadas pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) por meio de bolsas de estudo (SFRH/BD/87556/2012 e SFRH/BD/96026/2013, respectivamente).
Materials
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
Riferimenti
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