Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar
Summary
Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.
Abstract
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu küresel bir sağlık sorunudur. Dünya çapında etkilenen 350 milyondan fazla kişi ile, HBV enfeksiyonu karaciğer kanserinin önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Bu, özellikle gelişmekte olan ülkelerde önemli bir sorundur. Bağışıklık sisteminin HBV’ye karşı etkili bir yanıt vermemesi kronik enfeksiyona yol açar. HBV aşısı mevcut ve yeni antiviral ilaçlar oluşturulmaktadır rağmen, virüs-rezervuar hücrelerinin eradikasyonu önemli bir sağlık konusu olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan viral antijen üretimi için bir yöntemdir (Ag) -spesifik CD8+ sitotoksik T lenfositler (CTLs) indüklenen pluripotent kök hücrelerden türetilen (iPSCs) (yani, iPSC-CTLs), HBV replikasyonbastırmak için yeteneğine sahip. HBV replikasyonu farelerde hbv ekspresyonu plazmidi pAAV/HBV1.2’nin karaciğere hidrodinamik enjeksiyonu ile etkin bir şekilde indüklenir. Daha sonra, HBV yüzey Ag-spesifik fare iPSC-CTLs büyük ölçüde karaciğer ve kanda HBV replikasyon bastırır ve hepatositlerde HBV yüzey Ag ekspresyonunu önler, benimsenden aktarılır. Bu yöntem, hidrodinamik enjeksiyon sonrası farelerde HBV replikasyonu gösterir ve kök hücre kaynaklı viral Ag-spesifik CTLs HBV replikasyonbastırmak olabilir. Bu protokol HBV immünoterapi için yararlı bir yöntem sağlar.
Introduction
Akut enfeksiyon dan sonra, adaptif bağışıklık sistemi (yani, humoral ve hücresel bağışıklık) akut HBV ile ilgili hepatit toplu kontrol eder. Yine de, HBV-endemik bölgelerde insanların bir dizi virüsleri ortadan kaldırmak ve daha sonra kronik bireyler olarak dönüştürmek olamaz. Kronik hastaların %25’inden fazlası (>250 milyon kişi) dünya çapında ilerleyici karaciğer hastalığı gelişir ve karaciğer sirozu ve/veya hepatosellüler karsinom (HCC)1. Sonuç olarak, ısrarla enfekte hücrelerin eradikasyonu genel bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir, mevcut bir aşı olmasına rağmen2 ve çok sayıda antiviral ilaçlar geliştirilmektedir. HBV enfeksiyonu için standart tedavi IFN-α, nükleozit ve nükleotid analogları içerir. Bu ajanlar doğrudan antiviral aktivite ve bağışıklık modülatör kapasiteleri var. Bununla birlikte, HBe antijeninin (Ag)+ anti-HBe antikor (Ab) ve serum HBV deoksiribonükleik asit (DNA) kaybı ile birlikte seropdönüşümü tedavi edilen hastaların yaklaşık %20’sinde ayrı ayrı görünür ve virüsün tüm immünolojik kontrolü HBsAg yoksunluğu ile doğrulanan en fazla% 53. Ayrıca, tedaviye yanıt genellikle dayanıklı değildir. Rekombinant HBs Ag ile profilaktik aşılama enfeksiyonu önlemede son derece etkilidir, ancak terapötik HBs Ag aşısı etkili değildir. Açıkçası, T hücre aracılı bağışıklık yanıtları HBV enfeksiyonu ve karaciğer bozukluğu kontrolünde kritik bir rol oynamaktadır; ancak, kronik hepatit hastalarında, HBV-reaktif T hücreleri genellikle silinir, işlevsiz, ya da tükenmiş dönüştürmek4,5,6. Sonuç olarak, kalıcı HBV enfeksiyonu olan bireylerde, anti-viral ilaç, immüno-modüler sitokinler veya küratif bağışıklama yoluyla HBV’ye özgü bağışıklığı (yani T hücre tabanlı bağışıklık) geri getirme girişimleri başarıya ulaşamaz.
HBV Ag-spesifik T hücrelerinin benimseyen hücre transferi (ACT) sonunda kalan hepatositler wih HBV7ortadan kaldırmak için yönlendirilen etkili bir tedavidir,8. HBV’ye özgü KTK’ların HBV enfekte olmuş farelere aktiretinin geçici, hafif hepatite ve hepatositlerde HBV ribonükleik asit (RNA) transkriptlerinde dramatik bir düşüşe neden olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmalarda, CTLs HBV genlerin transkripsiyonunu inhibe etmedi ama HBV transkript bozulması gelişmiş9. HBV’ye özgü CtL’ler viral enfeksiyonu önlemek ve HBV10,11’intemizlenmesine aracılık etmek için önemlidir. ACT tabanlı ilaçlar için, in vivo resettlement için yüksek reaktivite ile HBV özgü T hücrelerinin in vitro genişleme ideal bir yöntem olduğu ileri sürülmüştür12,13,14; Bununla birlikte, mevcut yaklaşımlar potansiyel tedaviler için hastalardan HBV’ye özgü T hücrelerinin uygun miktar ve niteliklerini üretme, ayırma ve büyütme yetenekleri açısından kısıtlanmıştır.
Klinik çalışmalarda HBV virüs bulaşmış hepatositlere özgü mühendislik T hücreleri vasıtası ile hücre bazlı tedavilerin güvenliği, pratikliği ve prospektif terapötik aktivitesi mevcut olsa da, olumsuz etkileri hakkında endişeler vardır yanlış eşleşmeli T hücre reseptöründen çapraz reaktivite nedeniyle otoimmün yanıtlardan kaynaklanan (TCR)15,16, non-spesifik TCR17 tarafından hedef dışı Ag tanıma ve bir şierik Ag reseptörü (CAR) tarafından hedef dışı toksisite 18.000 , Sağlıklı dokularla 19. Şu anda, genetiği değiştirilmiş T hücreleri, sadece in vivo kısa süreli kalıcılık var, genellikle ara veya daha sonra etkili T hücreleridir. Bugüne kadar, pluripotent kök hücreler (PSCs) naif tek tip Ag-spesifik T hücreleri20, 21,22,23yüksek sayıda üretmek için kullanılabilir tek kaynaktır. İndüklenen PSC’ler (iPSC’ler) sadece birkaç transkripsiyon faktörünün gen transdüksiyonu yoluyla hastanın somatik hücrelerinden dönüştürülür. Sonuç olarak, iPSC’ler embriyonik kök hücreler (ESCs)24benzer özelliklere sahip. Doku replasmanına ek olarak, doku replasmanına ek olarak, kendini yenileme esnekliği ve olasılığı sayesinde, iPSC tabanlı tedaviler rejeneratif tıpta yaygın olarak uygulanabilir. Ayrıca, iPSCs altında yatan alaylar önemli ölçüde mevcut hücre tabanlı tedavileri artırabilir.
Bu yöntemin genel amacı, ACT tabanlı immünoterapi için iPSC’lerden (yani iPSC-CTLs) hbv’ye özgü ctl’ler üretmektir. Alternatif tekniklere göre avantajları HBV’ye özgü iPSC-CTL’lerin tek tip TCR ve naif fenotip olmasıdır, bu da ACT’den sonra daha fazla bellek T hücre gelişimiile sonuçlanır. HBV’ye özgü iPSC-CTL’lerin AKTIV’sinin karaciğerde fonksiyonel CD8+ T hücrelerinin geçişini artırdığı ve hem karaciğerlerde hem de yönetilen farelerin kanlarında HBV replikasyonlarını azalttığı gösterilmiştir. Bu yöntem HBV immünoterapi için viral Ag-spesifik iPSC-CTLs potansiyel kullanımını ortaya koymaktadır ve viral immünoterapi için diğer viral Ag-spesifik iPSC-T hücreleri oluşturmak için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bir murine modelinde HBV replikasyonlarını bastırmak için ACT olarak kullanılmak üzere viral Ag-spesifik iPSC-CTLs oluşturmak için bir yöntem sunar. Kronik HBV enfeksiyonunda viral genom kararlı bir mini kromozom oluşturur, hepatositin ömrü boyunca devam edebilen kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA). Viral mini kromozomun temizlenmesinin hedeflanması kronik HBV enfeksiyonunun tedavisine neden olabilir. Mevcut antiviral tedavi virüsün ters transkriptazını hedefler ancak nadiren cccDNA tara…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) için cDNA sağlamak için Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü’nden Dr Adam J Gehring teşekkür- özel A2-sınırlı insan-murine hibrid TCR genleri, ve Dr Pei-Jer Chen Ulusal Tayvan Üniversitesi sağlamak için pAAV/HBV 1.2 yapısı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe R01AI121180, R01CA221867 ve R21AI109239 J. S tarafından desteklenmiştir.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Riferimenti
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
- Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
- Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
- Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
- Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
- Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
- Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
- Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
- Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
- van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
- Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
- Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
- Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
- Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Ricerca sul cancro. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
- Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
- Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
- Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
- Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
- Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
- Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
- Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).
