Stamcelle afledte virale AG-specifikke T-lymfocytter undertrykker HBV-replikation i mus
Summary
Præsenteret her er en protokol til effektiv undertrykkelse af hepatitis B virus (HBV) replikation i mus ved at udnytte adoptiv celle overførsel (ACT) af stamcelle-afledte viral antigen (AG)-specifikke T-lymfocytter. Denne procedure kan tilpasses til potentiel ACT-baseret immunterapi af HBV-infektion.
Abstract
Hepatitis B virus (HBV) infektion er et globalt sundhedsproblem. Med over 350.000.000 mennesker ramt på verdensplan, HBV-infektion er fortsat den førende årsag til leverkræft. Det er et stort problem, især i udviklingslandene. Svigt af immunsystemet til at montere en effektiv respons mod HBV fører til kronisk infektion. Selv om HBV vaccine er til stede, og nye antivirale lægemidler er ved at blive skabt, udryddelse af virus-reservoir celler er fortsat et stort sundheds emne. Beskrevet her er en metode til generering af viral antigen (AG)-specifikke CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTLS) afledt af inducerede pluripotente stamceller (ipscs) (dvs. IPSC-CTLS), som har evnen til at undertrykke HBV-replikation. HBV-replikation induceres effektivt i mus gennem Hydrodynamisk injektion af et HBV-ekspression plasmid, pAAV/HBV 1.2, i leveren. Derefter, HBV overflade AG-specifikke mus iPSC-CTLs er adoptivt overført, hvilket i høj grad undertrykker HBV-replikation i leveren og blodet samt forhindrer HBV overflade AG ekspression i hepatocytter. Denne metode demonstrerer HBV-replikation i mus efter Hydrodynamisk injektion, og at stamcelle afledte virale AG-specifikke CTL’er kan undertrykke HBV-replikation. Denne protokol giver en nyttig metode til HBV-immunterapi.
Introduction
Efter akut infektion kontrollerer det adaptive immunsystem (dvs. humorale og cellulær immunitet) hovedparten af akut HBV-relateret hepatitis. Stadig, en række mennesker i HBV-endemiske regioner kan ikke fjerne virus og efterfølgende konvertere som kroniske individer. Mere end 25% af kroniske patienter (> 250 millioner mennesker) på verdensplan udvikler progressiv leversygdom, hvilket resulterer i levercirrhose og/eller hepatocellulært karcinom (HCC)1. Som følge heraf er udryddelse af insisterende inficerede celler fortsat et generelt problem med hensyn til sundhed, selv om der er en tilgængelig vaccine2 , og talrige antivirale lægemidler er under udvikling. Standard behandling for HBV-infektion omfatter IFN-α, nukleosid og nukleotidanaloger. Disse agenter har direkte antiviral aktivitet og immunmodulerende kapaciteter. Ikke desto mindre optræder serokonverteringen af HBe– antigen (AG) + bærere med anti-HBE-antistof (AB) og tab af serum HBV-deoxyribonukleinsyre (DNA) individuelt hos ca. 20% af de behandlede patienter, og hele den immunologiske kontrol af virusset kontrolleret ved fratagelse af HBsAg er ikke mere end 5%3. Desuden er reaktionen på behandlingen ofte ikke holdbar. Profylaktisk vaccination med rekombinant HBs AG er yderst effektiv til at forebygge infektion, men terapeutisk HBs AG vaccination er ikke effektiv. Det er klart, T celle-medieret immunrespons spiller en afgørende rolle i at kontrollere HBV-infektion og leverinsufficiens; Men, hos kronisk hepatitis patienter, HBV-reaktive T-celler er ofte slettet, dysfunktionelle, eller konvertere udmattet4,5,6. Derfor, hos personer med vedvarende HBV-infektion, ingen forsøg på at genindføre HBV-specifik immunitet (dvs. T celle-baseret immunitet) ved hjælp af anti-viral retsmiddel, immuno-modulerende cytokiner, eller helbredende immunisering har opnået succes.
Adoptiv celle overførsel (Act) af HBV AG-specifikke T-celler er en effektiv behandling rettet til i sidste ende udrydde resterende hepatocytter wih HBV7,8. Act af HBV-specifikke CTL’er til HBV-inficerede mus har vist sig at forårsage forbigående, mild hepatitis, og et dramatisk fald i HBV ribonucleinsyre Acid (RNA) transkriptioner i hepatocytter. I disse undersøgelser hæmmer CTLs ikke transkriptionen af HBV-gener, men forbedrede nedbrydningen af HBV-transkriptioner9. HBV-specifikke CTL’er er vigtige for at forebygge virus infektion og mægle clearance af HBV10,11. For Act-baserede retsmidler, in vitro udvidelse af HBV-specifikke T-celler med en høj reaktivitet for in vivo genbosætning er blevet foreslået at være en ideel metode12,13,14; ikke desto mindre er de nuværende tilgange begrænset med hensyn til deres evne til at generere, adskille og dyrke passende mængder og kvaliteter af HBV-specifikke T-celler fra patienter til de potentielle terapier.
Selv om kliniske forsøg nuværende sikkerhed, praktisk, og potentiel terapeutisk aktivitet af celle-baserede behandlinger ved hjælp af konstruerede T-celler, der er specifikke for HBV-virus-inficerede hepatocytter, der er bekymringer om de ugunstige virkninger som følge af autoimmune reaktioner på grund af tvær reaktivitet fra mispluftning T celle receptor (TCR)15,16, off-Target AG anerkendelse af ikke-specifik TCR17 og on-Target off-toksicitet af en chimerisk AG receptor (bil) 18 , 19 med sundt væv. I øjeblikket er de genetisk modificerede T-celler, som kun har kortvarige persistens in vivo, sædvanligvis mellemliggende eller senere Effector T-celler. Til dato, pluripotente stamceller (PSCs) er den eneste kilde til rådighed til at generere et stort antal naive enkelt-type AG-specifikke T-celler20,21,22,23. Inducerede kvikskranker (iPSCs) omdannes simpelthen fra en patients somatiske celler ved hjælp af gentransduktion af flere transkriptionsfaktorer. Som følge heraf har iPSCs samme karakteristika som embryonale stamceller (ESCs)24. På grund af fleksibiliteten og muligheden for uendelig evne til at forny sig selv, ud over vævs udskiftning, kan iPSC-baserede behandlinger anvendes bredt i regenerativ medicin. Desuden kan regimenter underliggende iPSCs væsentligt forbedre de nuværende cellebaserede terapier.
Det overordnede mål med denne metode er at generere en stor mængde HBV-specifikke CTL’er fra iPSCs (dvs. iPSC-CTLs) til ACT-baseret immunterapi. Fordelene i forhold til alternative teknikker er, at HBV-specifikke iPSC-CTL’er har en enkelt-type TCR og naiv fænotype, hvilket resulterer i mere hukommelse T celle udvikling efter handlingen. Det påvises, at den handling af HBV-specifikke iPSC-CTLs øger migrationen af funktionelle CD8+ T celler i leveren og reducerer HBV-replikation i både lever og blod af administrerede mus. Denne metode afslører en potentiel anvendelse af virale AG-specifikke iPSC-CTL’er til HBV-immunterapi og kan tilpasses til at generere andre virale AG-specifikke iPSC-T-celler til viral immunterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol præsenterer en metode til at generere de virale AG-specifikke iPSC-CTLs til brug som ACT til at undertrykke HBV-replikation i en murine model. Ved kronisk HBV-infektion danner det virale genom et stabilt mini-kromosom, det kovalent lukkede cirkulære DNA (cccDNA), der kan vare ved hele levetiden for hepatocyt. Målretning clearance af viral mini kromosom kan resultere i en kur af kronisk HBV-infektion. Aktuel antiviral behandling er rettet mod virus reverse transkriptase, men sjældent etablerer immunolog…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Adam J Gehring fra Toronto General Hospital Research Institute for at levere cDNA til HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-specifikke a2-Restricted Human-murine hybrid TCR gener, og Dr. Pei-jer Chen fra National Taiwan University for at give pAAV/HBV 1,2 konstruere. Dette arbejde støttes af National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 og R21AI109239 til J. S.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Riferimenti
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
- Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
- Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
- Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
- Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
- Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
- Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
- Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
- Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
- van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
- Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
- Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
- Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
- Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Ricerca sul cancro. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
- Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
- Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
- Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
- Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
- Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
- Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
- Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).
