Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen
Summary
Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.
Abstract
Infectie met het hepatitis B-virus (HBV) is een wereldwijde gezondheidskwestie. Met meer dan 350.000.000 mensenwereld wijd getroffen, de HBV infectie blijft de belangrijkste oorzaak van leverkanker. Dit is een grote zorg, vooral in ontwikkelingslanden. Falen van het immuunsysteem om een effectieve reactie tegen HBV te monteren leidt tot chronische infectie. Hoewel HBV-vaccin aanwezig is en nieuwe antivirale geneesmiddelen worden aangemaakt, blijft de uitroeiing van virus reservoir cellen een belangrijk gezondheids onderwerp. Hier beschreven is een methode voor het genereren van virale antigeen (AG)-specifieke CD8+ cytotoxische T lymfocyten (ctl’s) afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) (dat wil zeggen, IPSC-CTLS), die de mogelijkheid hebben om HBV-replicatie te onderdrukken. HBV-replicatie wordt efficiënt geïnduceerd bij muizen via hydrodynamische injectie van een HBV-expressie plasmide, pAAV/HBV 1.2, in de lever. Vervolgens, HBV oppervlak AG-specifieke muis iPSC-Ctl’s zijn adoptively overgebracht, die sterk onderdrukt HBV replicatie in de lever en bloed, alsmede voorkomt dat HBV oppervlakte AG expressie in hepatocyten. Deze methode demonstreert HBV-replicatie in muizen na hydrodynamische injectie en die door stamcel afkomstige virale AG-specifieke Ctl’s kunnen de HBV-replicatie onderdrukken. Dit protocol biedt een nuttige methode voor HBV-immunotherapie.
Introduction
Na acute infectie regelt het adaptieve immuunsysteem (d.w.z. de humorale en cellulaire immuniteit) het grootste deel van de acute HBV-gerelateerde hepatitis. Toch kunnen een aantal mensen in de HBV-endemische regio’s de virussen niet elimineren en vervolgens converteren als chronische individuen. Meer dan 25% van de chronische patiënten (> 250 miljoen mensen) wereldwijd ontwikkelen progressieve leverziekte, resulterend in levercirrose en/of hepatocellulaire carcinoom (HCC)1. Als gevolg daarvan blijft het uitroeien van de met de ziekte besmette cellen een algemeen gezondheidsprobleem, ook al is er een beschikbaar vaccin2 en zijn er talrijke antivirale geneesmiddelen in ontwikkeling. Standaardbehandeling voor HBV-infectie omvat IFN-α, nucleoside en nucleotide-analogen. Deze agenten hebben directe antivirale activiteit en immuun modulatoire capaciteiten. Niettemin verschijnen seroconversie van HBe-antigenen (AG)+ -dragers met anti-HBe antilichaam (AB) en verlies van serum HBV-deoxyribonucleïnezuur (DNA) afzonderlijk in ongeveer 20% van de behandelde patiënten en volledige immunologische controle van het virus geverifieerd door de ontbering van de HBsAg is niet meer dan 5%3. Bovendien is de respons op de behandeling vaak niet duurzaam. Profylactische vaccinatie met recombinant HBs AG is zeer effectief in het voorkomen van infecties, maar therapeutische HBs AG vaccinatie is niet effectief. Duidelijk, T cel-gemedieerde immuunresponsen spelen een cruciale rol bij het beheersen van HBV infectie en leverinsufficiëntie; echter, bij chronische hepatitis patiënten, HBV-reactieve T cellen worden vaak verwijderd, disfunctioneel, of omzetten uitgeput4,5,6. Dientengevolge, bij personen met aanhoudende HBV-infectie, geen pogingen om HBV-specifieke immuniteit (d.w.z., T cel-gebaseerde immuniteit) te herstellen door middel van anti-virale remedie, immuno-modulerende cytokines, of curatieve immunisatie hebben succes bereikt.
Adoptieve celoverdracht (Act) van HBV AG-specifieke T-cellen is een efficiënte behandeling gericht op het uiteindelijk uitroeien van resterende hepatocyten wih HBV7,8. ACT van HBV-specifieke Ctl’s in HBV geïnfecteerde muizen is aangetoond dat voorbijgaande, milde hepatitis veroorzaken, en een dramatische daling in HBV ribonucleïnezuur (RNA) transcripties in hepatocyten. In deze studies, Ctl’s niet remmen transcriptie van HBV genen maar verbeterde de afbraak van HBV transcripten9. HBV-specifieke Ctl’s zijn belangrijk om virale infectie te voorkomen en bemiddel de klaring van HBV10,11. Voor Act-based remedies is voorgesteld om in-vitro expansie van HBV-specifieke T-cellen met een hoge reactiviteit voor in vivo hervestiging een ideale methode te zijn12,13,14; Niettemin zijn de huidige benaderingen beperkt met betrekking tot hun capaciteiten om de juiste hoeveelheden en kwaliteiten van HBV-specifieke T-cellen van patiënten voor de mogelijke therapieën te genereren, te scheiden en te laten groeien.
Hoewel klinische proeven aanwezige veiligheid, uitvoerbaarheid, en potentiële therapeutische activiteit van cel-gebaseerde behandelingen door middel van engineered T cellen die specifiek zijn voor HBV virus geïnfecteerde hepatocyten, er zijn zorgen over de ongunstige effecten die zich voordoen bij auto-immuunresponsen vanwege cross-reactiviteit van de verkeerde T Cell receptor (TCR)15,16, off-target AG herkenning door niet-specifieke TCR17 en on-target off-toxiciteit door een chimeer AG receptor (auto) 18 , 19 met gezonde weefsels. Op dit moment zijn de genetisch gemodificeerde T-cellen, die alleen kortstondige persistentie in vivo hebben, meestal tussenliggende of latere Effector T-cellen. Tot op heden zijn pluripotente stamcellen (pscs) de enige bron die beschikbaar is voor het genereren van hoge aantallen naïeve single-type AG-specifieke T-cellen20,21,22,23. Geïnduceerde PSCs (iPSCs) worden eenvoudig omgezet van somatische cellen van een patiënt door het gebruik van gentransductie van verschillende transcriptiefactoren. Als gevolg hiervan hebben de iPSCs vergelijkbare kenmerken als die van embryonale stamcellen (ESCs)24. Vanwege de flexibiliteit en de mogelijkheid voor het oneindige vermogen om zichzelf te verlengen, kunnen, naast weefsel vervanging, iPSC-behandelingen op grote schaal worden toegepast in regeneratieve geneeskunde. Bovendien kunnen de onderliggende regimenten van iPSCs de huidige op cellen gebaseerde therapieën aanzienlijk verbeteren.
Het algemene doel van deze methode is om een grote hoeveelheid HBV-specifieke Ctl’s te genereren van iPSCs (d.w.z. iPSC-CTLs) voor op ACT gebaseerde immunotherapie. De voordelen ten opzichte van alternatieve technieken zijn dat HBV-specifieke iPSC-Ctl’s een single-type TCR en naïef fenotype hebben, wat resulteert in meer geheugen T celontwikkeling na de ACT. Het is aangetoond dat de wet van HBV-specifieke iPSC-CTLs verhoogt de migratie van functionele CD8+ T cellen in de lever en vermindert HBV replicatie in zowel de levers en bloed van de toegediende muizen. Deze methode onthult een potentieel gebruik van virale AG-specifieke iPSC-CTLs voor HBV-immunotherapie en kan worden aangepast om andere virale AG-specifieke iPSC-T-cellen voor virale immunotherapie te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol presenteert een methode voor het genereren van de virale AG-specifieke iPSC-CTLs voor gebruik als ACT te onderdrukken HBV replicatie in een model van de Murine. Bij chronische HBV-infectie vormt het virale genoom een stabiel mini-chromosoom, het covalent gesloten cirkelvormige DNA (cccDNA) dat gedurende de levensduur van de hepatocyte kan aanhouden. Gericht op de klaring van het virale mini-chromosoom kan resulteren in een genezing van chronische HBV-infectie. De huidige antivirale therapie richt zich op het…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Adam J Gehring van het Toronto General Hospital Research Institute voor het verstrekken van cDNA voor HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-specifieke a2-beperkte humane-Murine Hybrid TCR-genen, en Dr. Pei-Jer Chen van de nationale universiteit van Taiwan voor het verstrekken van pAAV/HBV 1,2 construct. Dit werk wordt ondersteund door het National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 en R21AI109239 to J. S.
Materials
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Riferimenti
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
- Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
- Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
- Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
- Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
- Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
- Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
- Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
- Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
- Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
- Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
- van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
- Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
- Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
- Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
- Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Ricerca sul cancro. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
- Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
- Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
- Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
- Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
- Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
- Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
- Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).
